作者xy234786 (阿亮)
看板Biotech
標題[求救] commasie 染色後的蛋白lysate沒有band
時間Thu Jul 27 23:34:21 2017
請問各位，小弟收取10^7的陰道鞭毛蟲，使用lysis buffer(4%CHAPS,8M urea)後，離心
取上清液測蛋白濃度有30mg/ml，之前以4倍稀釋劑跑膠，染完commasie blue 後，得出的
結果竟是如圖一樣，完全沒有banding，而是smear一條一條，這樣是正常的嗎？
http://i.imgur.com/Q5mxKYR.jpg
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1F：→ xy234786: 正常來說總蛋白lysate去跑應該要有一條條各種大小蛋白 07/27 23:37
2F：→ xy234786: 的band吧？ 我這樣是因為沒有破細胞破完全嗎？ 07/27 23:37
3F：→ Ianthegood: 可以錯的地方很多 細胞 lysis page coomassie 07/28 02:38
4F：→ Ianthegood: 每一步都要有control 07/28 02:39
5F：→ xy234786: 細胞指的是太少嗎？ lysis buffer我是照著學長給的配 07/28 09:01
6F：→ xy234786: 需要sonicator打破嗎？ 膠的部份應該沒有問題 正常的配 07/28 09:01
7F：→ xy234786: 12%膠 染色我染10分鐘後就多換幾次清水... 07/28 09:01
8F：→ Ianthegood: "control" 07/28 17:57
9F：→ Ianthegood: 旁邊跑一個新鮮的bsa就知道問題在哪一端 07/28 17:58
11F：→ xy234786: 我用我之前的純化蛋白跑在旁邊，這樣代表什麼呢 07/29 10:59
12F：→ jsi: 看起來膠跟染劑沒問題，靠近marker的sample隱約有淡淡的band 07/29 14:39
13F：→ jsi: 可能是蛋白質量少(細胞破裂程度不夠，或細胞數量太少)，不過 07/29 14:41
14F：→ jsi: 有時候在WB，經由抗體抗原結合+放大效應，會有比較明顯的band 07/29 14:42
15F：推 jsi: 可考慮用濃度較高的sample跑膠，若lysis buffer不會干擾跑膠 07/29 14:45
16F：→ jsi: 甚至可以不要加稀釋液 07/29 14:46
17F：→ xy234786: 如果是破細胞破不完全，會測的到30mg/ml這樣的濃度嗎？ 07/29 19:31
18F：→ xy234786: 那如果這樣是不是要用sonicator再破會畢較好 07/29 19:31
19F：→ jsi: 我不了解陰道鞭毛蟲特性，無法判斷您lyse cell過程是否足夠， 07/29 22:38
20F：→ jsi: 加入lysis buffer後sonicate或其他增加蛋白質暴露的方法都值 07/29 22:40
21F：→ jsi: 得一試，要注意溫度或其他條件，避免蛋白質遭受破壞。您用 07/29 22:41
22F：→ jsi: urea，需先確認是否會干擾蛋白質濃度測定試劑，是否有偽陽性 07/29 22:44
23F：→ jsi: 的問題存在? 07/29 22:44
24F：→ xy234786: 我是使用nanodrop測定，並以lysis buffer做為blank 07/30 10:30
25F：→ xy234786: 會不會是有可能蛋白都degrade了，斷了，但仍然測的到高 07/30 10:31
26F：→ xy234786: 濃度 07/30 10:31
27F：推 joseph103331: 吸光值不太準 用Bradford定量看看 07/30 10:46
28F：→ xy234786: 我也使用braford試過了 確實有這樣的濃度 07/30 13:43
29F：→ xy234786: 我使用sonicatorhttp://i.imgur.com/Rya8ioU.jpg後的跑 08/02 14:29
30F：→ xy234786: 膠結果 08/02 14:29
31F：→ xy234786: 這樣算正常嗎？ 08/02 14:29
32F：推 Ianthegood: 比較好一點囉 看來是本來你的蟲的expression就比較平 08/02 16:23
33F：→ Ianthegood: 淡一點沒什麼特別高的gene? 08/02 16:23