作者kaofei (phoebe)
看板Biotech
標題[求救] phenol-chloroform的貯存時間...
時間Sun Jul 23 22:53:26 2017
我因為某些原因需用傳統法純化ligation完的DNA
再買新的試劑前發現實驗室有放很久很久(可能超過五年吧= =)
的phenol-chloroform isoamyl alchohol (25:24:1)
一直冰在四度c，棕色瓶，顏色還是純淨透明的 (有可能還沒開過)
聽說這個試劑的萃取效率會逐漸變差
我看大部分的有效日期頂多到一年
想請問這樣還可以用嗎= =?
今天有拿plasmid試著抽，方法大致如下 (有可以加強的麻煩指點>"<)
100 ul DNA與試劑等體積混合均勻後
13000 rpm, RT離5分鐘後取水層 (沒有repeat)
直接進酒精沉澱
先加0.5倍體積的 7.5M ammonium acetate然後加2.5倍體積的100%酒精
-80三小時
然後15000 rpm, 4度c 30分鐘
之後用預冷的70%酒精wash兩次 (只有第一次有看到pellet)
air dry，用PCR grade water回溶
測得濃度只有原先的0.4倍，260/280只有1.5多...
我之後純化完的DNA要用做ivt的template
之前都用column純化，但好像量會比較少，也沒法去除endogenous RNase
所以就被建議用傳統法抽，但目前實驗室沒人有經驗
所以想請問版上大大相關的問題，以及操作上要注意的地方
還請不吝回答orz謝謝
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※ 編輯: kaofei (101.0.152.172), 07/23/2017 22:53:47
※ 編輯: kaofei (101.0.152.172), 07/23/2017 22:54:19
1F：推 tynse71864: 沒印象要加 ammonium acetate耶 07/24 01:05
2F：→ Ianthegood: 要加阿 我學的protocol是加1/10體積的5M amonium acet 07/24 01:08
3F：→ Ianthegood: ate 不過多加好像也沒差 07/24 01:08
4F：→ Ianthegood: wash離久一點唄 07/24 01:08
5F：推 tynse71864: 我直接加純酒精-20度，1h就離心了 07/24 01:15
6F：→ kaofei: 也有人加3M sodium acetate但我不曉得跟Ammino有甚麼差 07/24 08:49
7F：→ kaofei: 所以，PCI放這麼酒還是可以用的嗎？是否沒變紅就是沒氧化 07/24 08:50
8F：推 tynse71864: 試過 Na acetate; 用途跟 ammonium acetate應該都是增 07/24 13:07
9F：→ tynse71864: 加離子濃度，讓 dna更易被EtOH沉澱下來 07/24 13:07
10F：推 tynse71864: 我家的 PCI是放了快3年囧 但還能抽的出來 07/24 13:20
11F：推 joseph103331: 不夠純的話PC可以萃兩次囉 07/24 16:52