作者kaofei (phoebe)
看板Biotech
標題[求救] re-ligation的問題
時間Mon May 29 17:46:33 2017
大家好
就是，如果我有很多個dna片段，用限制酶有specific的overhang後
分組用T4 ligase作用overnight後，純化再接出全長
ex: ABCDEF個fragments，AB CD EF各自接好後，再AB+CD+EF接
想請問
在第二次ligation時會需要注意甚麼嗎？
當初限制酶切出了overhang會有可能再第一輪接完cleanup的過程中掉掉嗎？
第一輪的T4 ligase會需要inactivation嗎？如果沒有會影響religation的效率嗎？
歐然後想順便請問有人遇過接出大片段的DNA(~30kb)後跑膠與Marker不符的情形嗎？
我看paper有些人indicate的產物(明明應該比marker大)跑膠後卻比marker低
因為我自己也遇到了類似的情形，我的產物(~30kb)怎樣都比marker 25 kb的band低
就不知道是真沒接到某個片段(那次實驗室六個片段pool一起接的)
還是這是有可能的orz...
謝謝大家幫忙解惑
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 36.227.43.236
※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1496051196.A.194.html
1F：→ xxtomnyxx: 最後產物是環狀的還是線性的？ 05/29 20:43
2F：→ kaofei: 是Linear，但這就有個問題是會不會頭尾ligate變環形...當 05/29 23:40
3F：→ kaofei: 初設計primer時沒想到orz 覺得會是個隱憂 05/29 23:41
4F：→ kaofei: 頭尾是blunt end 05/29 23:42
5F：→ Ianthegood: blunt超難 想接都接不起來 05/30 00:34
6F：→ blence: (我的經驗)幾乎所有ligation protocol都建議RE切完做gel 05/30 00:44
7F：→ blence: elute或cleanup來移除不要的片段,所以overhang不至於掉掉 05/30 00:44
8F：→ blence: 這樣,第一次的ligase也沒有inactivation的問題 05/30 00:46
9F：→ blence: primer一般合成的時候5'沒加P,PCR後頭尾還是黏不起來,不過 05/30 00:50
10F：→ blence: 如果blunt end是切出來的,AE應該可以形成環形了 05/30 00:52
11F：→ icheee: 同上 blence 大大 overhang 在 per cleanup 應該穩定 而因 05/30 17:39
12F：→ icheee: 為已經有 cleanup 所以不需要事先 inactivate ligase 05/30 17:40
13F：→ kaofei: 嗯嗯，謝謝大大們的回答。所以如果都是PCR產物，頭尾Blunt 05/30 20:52
14F：→ kaofei: end接的機率不高，兩次ligation中間也不需要inactivation 05/30 20:53
15F：→ kaofei: 我是都有cleanup。會擔心頭尾接是因為我之前cloning都是 05/30 20:55
16F：→ kaofei: 都用pJET2.1，是blunt-end ligation..但可能kit還是不一樣 05/30 20:56
17F：→ blence: 狀況不同,pJET blunt-end有P,PCR product可直接接進去 05/30 21:31
18F：→ blence: 但你的A,E如果是PCR形成的blunt-end,兩端都沒P阿 05/30 21:37
19F：推 joseph103331: 如果site都不一樣的話,就用RE切切看產物就知道有沒 05/31 01:23
20F：→ joseph103331: 有形成環形了,也有可能只是跑膠誤差啦 05/31 01:27
21F：→ kaofei: 好的！謝謝大大們熱心解惑Q__Q！有Biotech版真好 05/31 09:58
22F：→ xxtomnyxx: 對了，溶DNA的buffer如果和marker的buffer差太多，也會 05/31 16:01
23F：→ xxtomnyxx: 影響DNA跑的位置 05/31 16:01
24F：→ Ianthegood: 看你是用什麼buffer system跑啦 tae其實對buffer salt 05/31 18:34
25F：→ Ianthegood: 的tolerance極高... 05/31 18:34
26F：→ kaofei: 我們家都用TBE耶，會對鹽類比較不耐嗎？ 05/31 21:57
27F：推 Ianthegood: 如果是la或lb這種次世代的就會比較敏感 tae tbe都滿耐 06/01 04:39
28F：→ Ianthegood: 的 06/01 04:39