作者kaofei (phoebe)
看板Biotech
標題[方法] DNA purification(~30kb)
時間Sun May 7 11:36:15 2017
大家好，前情提要如下：
我用T4 ligase黏了一段大概近30kb的dsDNA
之後要做in vitro transcription
理論上我應該要跑膠切膠純化...= =
但這個步驟感覺會lose很多 (看到比較適合的是Zymo的，約50-70%大片段回收率)
所以我就只純化接著往後做看看
所以我想問的是
我看qiagen blood & tissue他們elute最主要的就是約30kb的DNA
但第一次離心前我應該要有個DNA binding的動作
blood & tissue裡沒有
我想到的作法是：
1. ligation 200+ 加酒精 200跟buffer AL 200 離心然後之後AW1、AW2...
2. ligation 100+ mini裡的PB binding buffer 500，離心，然後AW1、AW2...
3. Isopropanol沉澱法
但我不是很熟要怎麼調整鹽類的濃度...有人可以指點我一下嗎orz
不知道有沒有人這樣modify過或類似經驗可以分享看看
謝謝>"<
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1F：→ Ianthegood: 你是黏完linear的直接做ivt? 不先clone起來? 05/07 18:42
2F：→ Ianthegood: isopropanol precipitation有鹽沒鹽基本上沒差反正你 05/07 18:45
3F：→ Ianthegood: 要調整到300mM NaOAc (或其他適合的鹽) 05/07 18:45
4F：→ kaofei: 30kb要clone的話就要用pBAC了吧...但我家沒有那種Vector 05/08 09:20
5F：→ kaofei: 所以只要加NaOAc就好~但又有沒加沒差是說沒有也可以囉XD"? 05/08 09:21
6F：→ Ianthegood: 你裡面原本有什麼鹽沒差 不加naoac你就等著離半天都 05/08 15:39
7F：→ Ianthegood: 離不出東西XD 05/08 15:39
8F：→ Ianthegood: 我是覺得想辦法clone起來比較好 如果你下游出錯你還要 05/08 15:41
9F：→ Ianthegood: 從ligation開始做 感覺很蠢 05/08 15:41
10F：→ silverberry: 同推先 clone 出來。30 kb 有 mutation 怎麼辦? 05/08 18:49
11F：→ silverberry: 然後建議用 QIAEX II，最大可以抓到 50 kb。 05/08 18:50
12F：→ silverberry: 實戰用過 55 kb 沒問題。 05/08 18:51