作者migu0531 (migu0531)
看板Biotech
標題[求救] 蛋白純化解凍後出現沉澱
時間Mon May 1 22:14:25 2017
最近遇到蛋白的問題……做了好多批都這樣
蛋白是用昆蟲細胞表現的，經過I-per破細胞（有加PMSF）、離心後，用Ni -column純化
elute buffer= 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 250mM imidazole, pH8.0
蛋白純化完放4度 2、3天沒有看到沉澱。原本是想說測完蛋白濃度後，再加甘油放-20度
保存。但遇到六日又怕蛋白降解，所以直接放-20度
禮拜一冰上解凍後，出現白色沉澱，用Bio rad protein dye測蛋白濃度可以看到藍色顆
粒物（應該是我的蛋白……）
請問改怎麼辦？（之前別的蛋白有做過濃縮與PBS置換，直接凍-20就沒這樣。)
為什麼會沉澱？後續要做elisa 篩血清，沉澱物應該不能用
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1F：推 rasaze: 多試幾種不同的buff啊...... 05/01 22:21
2F：→ migu0531: 前一個elution buffer是用20mM sodium phosphate, 0.5M 05/01 22:31
3F：→ migu0531: NaCl, 500mM imidazole,pH 7.4 ，也是會沉澱 05/01 22:31
4F：推 oceanl: 沈澱物經過vortex後會溶解嗎？之前遇過會再溶回去的 05/01 22:34
5F：→ migu0531: 沉澱物用PBS溶不了……我的蛋白啊啊 05/01 22:37
6F：推 oceanl: 那你只好純化完馬上置換buffer了...(默） 05/01 22:43
7F：推 s992003: 是不是有些蛋白不適合冷凍，我有買過蛋白然後建議不要冷 05/01 22:46
8F：→ s992003: 凍的，比冷藏還容易壞 05/01 22:46
9F：→ migu0531: 蛋白不建議冷凍我就不清楚了！ 只知道不建議反覆凍溶。 05/01 23:09
10F：→ migu0531: 蛋白真是條不歸路…… 05/01 23:09
11F：推 Invec: 高濃度imidazole最好不要冷凍，立刻置換buffer比較理想 05/02 00:21
12F：→ Ianthegood: 做protein就不要期待週末可以放假了... 05/02 01:56
13F：→ Ianthegood: column elute下來就透析吧 05/02 01:57
14F：推 icheee: 推 Invec 高 imidazole 不要凍... 而且一般凍會作 flash 05/02 05:15
15F：→ icheee: freezing 吧? 你說直接放 -20C 有經過 flash freezing 嗎? 05/02 05:16
16F：→ migu0531: Flash freezing?應該沒有……蛋白就直接從4度丟到-20， 05/02 07:17
17F：→ migu0531: 什麼也沒做也沒加東西 05/02 07:17
18F：→ migu0531: 想問問大家，都用什麼方法置換buffer? 目前我有用過amic 05/02 07:21
19F：→ migu0531: on離心加buffer順便濃縮。還有AKTA的desalting column， 05/02 07:21
20F：→ migu0531: 但蛋白就被大量稀釋，連western都認不到，根本不知道再 05/02 07:21
21F：→ migu0531: 哪個fraction出來…… 05/02 07:21
22F：推 icheee: Amicon/dialysis/ultrafiltration/desalting column 05/02 07:36
23F：→ icheee: Akta desalting column 連 280 吸收都看不到嗎？之前也有 05/02 07:37
24F：→ icheee: 用過 pd-10 這種 open column 還算省事 05/02 07:38
25F：→ migu0531: 有一個很小很小的peak，但跑膠跟western一片空白 05/02 08:24
26F：推 rasaze: 那應該是你的protein沉澱卡在column裡面了... 05/02 09:18
27F：→ rasaze: desalting column了不起稀釋濃度2-5倍而已 WB不會看不到 05/02 09:19
28F：推 icheee: 是第一次純化的蛋白？目標 buffer 是有文獻參考或繼承別人 05/02 13:29
29F：→ icheee: 的 protocol? 05/02 13:30
30F：推 icheee: 全新 protein 可能 buffer condition 要多試試 (這是在假 05/02 13:34
31F：→ icheee: 設你表達的條件/nickel column 純化條件都沒問題的狀況下) 05/02 13:35
32F：推 icheee: 另外關於溫度, 確實有些蛋白在室溫可能還比4度/-20度穩定 05/02 13:37
33F：→ icheee: 這就要自己試; 回到凍的方式, 一般我是都丟液氮 flash 05/02 13:38
34F：→ icheee: freezing, 避免 cold denaturation 05/02 13:39
35F：→ icheee: 然後存 -80 05/02 13:39
36F：→ migu0531: 接別人的蛋白，但留下的資料不多，只知道之前的人是用ak 05/02 20:30
37F：→ migu0531: ta pure純化，我也照做，但還是沉澱。 05/02 20:30
38F：→ migu0531: 另外很奇怪的事,我有配一瓶10倍的binding buffer 放4度 05/02 20:38
39F：→ migu0531: 幾天就出現片狀的結晶沉澱…… 不知道使用的二次水有無 05/02 20:38
40F：→ migu0531: 問題? 05/02 20:38
41F：→ icheee: 10x buffer 低溫可能鹽析出而已 05/02 22:14
42F：推 MujiCat: 低溫乾燥離心機可以濃縮代換buffer的樣本 ，但若有其他鹽 05/05 08:48
43F：→ MujiCat: 類存在也會一起被濃縮 05/05 08:48