作者s992003 (Lord of Ethanol)
看板Biotech
標題[求救] 大腸桿菌表達問題
時間Mon May 1 18:11:02 2017
哈囉各位大大
小弟在做重組蛋白的表達
最近因為業務的推薦
把表達的菌株從原先的BL21換成C43（DE3) plyss
第一步送vector到菌裡面塗盤沒問題
第二步要從盤上篩選較強的菌這邊有些疑問
學長姐傳下來的做法是挑幾個較大的菌株
都把他們搖16小時然後破菌
不用離心分掉膜跟細胞質 直接western看表現量
選Band深的就對了
請問這樣的做法是正確的嗎？
上網查有聽說要測什麼copy number但不知道要怎麼測量
另外想問要怎麼確認我的蛋白產生inclusion body
這個蛋白是周邊膜蛋白，但paper推測的穿膜區域已經把他切掉了
之前用BL21表達
測試好幾種detergent 還有不同濃度的條件
都沒辦法溶出很多蛋白
也沒有能做活性測試的材料
所以不知道有沒有產生inclusion body
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1F：推 mosu0714: copy number從你用的plasmid去追查就知道了吧 05/01 20:40
原來copy number完全是跟基因有關 跟後面的事情無關!?
會不會我這個蛋白試了各種條件都沒起色就是因為用了濫vector QQ
2F：→ milkpa: TM拿掉應該就是有機會soluble了吧，為啥還用C43？ 05/01 21:00
我們本來都這樣子想，但跑膠結果看起來還是一堆卡在膜上的樣子，不知道如何是好
※ 編輯: s992003 (123.205.17.239), 05/01/2017 21:46:07
3F：→ Ianthegood: copy number跟plasmid的ori有關 05/02 01:07
4F：→ Ianthegood: 你要做活性還要收inclusion body? refolding比擲杯還 05/02 01:08
5F：→ Ianthegood: 難啊 05/02 01:08
6F：→ icheee: 聽起來是本來想要透過測活性來看有沒有 inclusion body 05/02 05:35
7F：→ icheee: 但是沒有測活性的 assay 所以想要用其他方式判斷是否產生 05/02 05:36
8F：→ icheee: inclusion body? 05/02 05:36
我不想要inclusion body，但是不知道有沒有發生inclusion body
i大沒錯，我的想法是聽說inclusion body的蛋白通常不會具有活性，想看活性來判斷
現在跑膠來看感覺蛋白卡死在膜上，用detergent溶出的效果極差，但不確定是否產生inclusion body
我以為C43 plyss會有比較好的結果，比BL21貴兩倍說QQ
※ 編輯: s992003 (140.128.123.73), 05/02/2017 09:09:23
9F：推 icheee: 測表達條件我會離心分 supernatant 跟 pellet 然後跑膠看 05/02 13:44
10F：→ icheee: 看 induction 有沒有成功 並看是不是 soluble 05/02 13:46
11F：→ icheee: （不過很久沒表達/純化蛋白了，有錯請大家指正>< ） 05/02 13:47
12F：→ Ianthegood: 如果有閒錢的話 買一點bugbuster 看soluble/ib非常方 05/02 20:18
13F：→ Ianthegood: 便 而且small scale可以用很久 05/02 20:18