作者k60351p (misakilin)
看板Biotech
標題[求救] WB strip strip可信度
時間Thu Apr 27 21:50:11 2017
想問一下版上的前輩們
我最近在跑WB
想看某個KINASE的磷酸化
依照別人的建議是先壓PHOSPHO
再壓TOTAL
但第一次結果出來磷酸化的確有改變趨勢
但是TOTAL的部分也有改變的現象
不確定是否是strip所造成的誤差還是什麼?
（internal control沒問題，抗體是abcam，commercial stripping buffer）
想問phospho跟total在同一個位子
用strip壓是否有可信度的問題?
（sample量有點多，如果都要跑二重覆會有加不完的班。。。）
另外想問，如果壓出來的band偏淡，而且背景較深，是應該調二抗還是一抗的比例?還是應該調整blocking的方式
（5%skim milk blocking ,santa cruz 的抗體（非磷酸化），一抗 1:500 二抗1:5000）
麻煩大家給我一點意見，謝謝
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1F：→ Bows: totel 也是有改變的可能，背景可以用 2~5% BSA 做blocking 04/27 22:55
好喔～下次換blocking方法看看，但是好怕被罵燒錢QQ
2F：推 milkpa: 有影響，有遇過磷酸化跟一般抗體會競爭的，所以後來直接 04/28 00:29
3F：→ milkpa: 跑兩片以internal control做比較。（遇過reviewer要求 04/28 00:30
4F：→ milkpa: 「所有」WB三重複的，實驗室總動員做到死.....） 04/28 00:31
希望我畢業前不用投稿or遇到兇猛的reviewer ....
※ 編輯: k60351p (114.42.70.234), 05/01/2017 23:01:50
※ 編輯: k60351p (114.42.70.234), 05/01/2017 23:02:42
5F：推 ararthur: Phospho protein 建議用BSA blocking 所以total protein 05/11 14:44
6F：→ ararthur: 也必須用BSA blocking 我覺得是blocking buf的問題 05/11 14:45
7F：→ ararthur: 另外 total protein 本來就可能會變化 特別是隨著磷酸化 05/11 14:46
8F：→ ararthur: 的比例變化 因為該treatment大概就是需要這蛋白活性 量 05/11 14:47
9F：→ ararthur: 也通常跟活性成正比 05/11 14:47