作者cathy50121 (阿希希)
看板Biotech
標題[求救] 4%PFA固定細胞問題
時間Wed Apr 26 12:16:20 2017
想請問各位做過ICC的大大們，
事情是這樣的，我們老師要求我在做ICC之前先試試用PFA固定細胞(在tube裡)，然後上Flow cytometry來確認PFA固定會不會影響到抗體的binding，所以我剛才就試著用上flow的方式來固定細胞，但是在PBS wash兩次之後細胞就消失了，根本還來不及stop
請問用PFA固定細胞是不是一定要貼片的細胞呢？？我不知道問題出在哪裡QQ
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1F：→ cyc5566: 我上flow是用酒精固定,不是PFA 04/26 12:55
2F：→ cathy50121: 我們老師想用flow確認PFA固定會不會影響到抗體binding 04/26 13:03
3F：→ cathy50121: ，確認之後才可以做ICC 04/26 13:03
4F：→ tz2733: 細胞就消失是什麼意思?肉眼在tube看不到pellet嗎? 應該只 04/26 15:04
5F：→ tz2733: 是離心次數多了 流失細胞使細胞數變少而看不到 且PFA固定 04/26 15:04
6F：→ tz2733: 似乎會使細胞變小而更看不到pellet 但硬作下去上機還是有 04/26 15:04
7F：→ tz2733: 機會看到細胞的... 只是要試為何不就直接用ICC試? 04/26 15:04
8F：→ a90648: 我全血有用過PFA, acetone和Glutaraldehyde都固定沒問題 04/26 15:05
9F：→ lail: 肉眼看不到但是可能還是有細胞 04/26 15:26
10F：→ cathy50121: 我也想問我們老師為什麼要我用flow上QQ 04/26 15:48
11F：→ cathy50121: 請問全血如果用福馬林對血球會很傷嗎？？ 04/26 15:49
12F：→ cathy50121: 等等去上機看看，希望開獎成功 04/26 15:49
13F：推 Ianthegood: "formaldehyde對細胞很傷嗎"??? 所有fixation都是直 04/26 16:28
14F：→ Ianthegood: 接把細胞殺死並且保存某種特性啊 pfa主要是morphology 04/26 16:28
15F：→ Ianthegood: 你的protocol是什麼? 04/26 16:29
16F：→ cathy50121: 我這次上flow是先用FACS回溶後離心，加同體積的pfa冰 04/27 13:02
17F：→ cathy50121: 上固定15分鐘，再離心後用pbs洗兩次，過程全部在tube 04/27 13:02
18F：→ cathy50121: 內，洗兩次後就看不太到細胞了所以沒有洗第三次，也沒 04/27 13:02
19F：→ cathy50121: 有stop，就直接染色然後上機 04/27 13:02
20F：→ Ianthegood: 離久一點啊 fix後會比較強壯 04/27 15:36
21F：→ cathy50121: 喔喔好的！那轉速需要提高嗎？？我是用1800rmp 04/27 18:03
22F：→ Ianthegood: 在沒有rotor information的情況下rpm一點意義都沒有 04/28 00:03
23F：→ Ianthegood: 請報g值 04/28 00:03
24F：→ Ianthegood: 先離久一點看看 不夠再加速 04/28 00:04