作者blence ( )
看板Biotech
標題[閒聊] reporter assay從設計到完成需要多久？
時間Tue Apr 18 23:27:46 2017
純粹閒聊
實驗室難免會遇到一些實驗需要與時間賽跑，
以reporter assay來說，
當老闆的可能自星期一交代以下這項工作，
目的是探討一段約500bp的promoter活性，
同時要一起比較若上面帶有與疾病有關的單點突變，
活性又會有什麼變化
由於實驗室必定沒有coustruct，只能從訂primer著手，
所以老闆想看到初步data的話，
大概要給多少時間(自星期一起算)是合理的？
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1F：推 jabari: 老闆急，半天都合理。 老闆不急，三年也合理。 04/19 00:47
2F：推 jabari: 如果不是計畫案的充要條件，就放寬心 然後忘記orz 04/19 00:49
3F：推 Bows: 順利3週不順半年 04/19 01:01
的確急，剩不到四週的時間就要出國給talk
不過沒有概念，還以為這段時間內reporter看到差異時，是不是順便補ChIP
當下問需要多久時沒想太多，想說出國前生出來就好了
後來照時間序算一下也的確要三週才有結果
也就是cloning, site-direct mutagenesis, reporter常規流程各約需一週
看起來我應該沒拖延
4F：→ lail: 要做的事情其實蠻雜的，而且PCR有可能不成功還要試條件等等 04/19 01:27
5F：→ lail: ，我覺得如果是新手老闆可能要關心一下每個階段的進度比較保 04/19 01:27
6F：→ lail: 險，熟手也很難說，因為通常同時會需要做其他事情，所以在 04/19 01:27
7F：→ lail: 不確定背景資料下很難有一個一定的標準 04/19 01:27
8F：→ huuban: reporter assay有多種吧，你預計怎進行? 04/19 16:30
是沒有一個標準，所以一開始就先說只是閒聊阿
如果要認真的討論就會涉及細節跟習慣了
以我們來說，一直以來都是用promega dual luciferase system
所以像這次reporter就會設計接到pGL3-basic/-promoter vector
再選個泛用的(Hela)跟主題相關的各一株細胞來測試結果
在台北地區的好處是訂primer跟之後送訂序都有廠商在一天內完成
所以我認為時間上的瓶頸應該是第一次PCR必需要有band
雖然最普遍的人類序列好像買clone省事
但基於期貨運送的耗時與這些序列的特殊性
想三週內完成任務似乎是自己接最快
這次其實有六個不同chr片段需要嘗試
隨便算，想要全部失敗的機率可能只有(0.5^6)=1.56%
幸好今晚剛看這六盤都長了colony了
期望這其中有幾個在下週末就能測試reporter assay結果
9F：→ Sylvaine: 可以想想reporter assay從做construct到測定完需要做哪 04/19 16:43
10F：→ Sylvaine: 些事、目前有哪些可以先做，然後定時跟老闆報告你做到哪 04/19 16:45
11F：→ Sylvaine: 裡吧~~ 04/19 16:45
※ 編輯: blence (180.218.151.4), 04/19/2017 22:34:14
12F：→ untilnow: 很順的話應該是2-3個月 04/19 23:02
13F：→ untilnow: 用PERT法估計 最有可能出現DATA的時間在2.8個月左右 04/19 23:04
14F：推 lail: 如果實驗室不缺經費人力，就找四個人同時進行reporter，chip 04/20 06:12
15F：→ lail: ，dapa或emsa，只要有一個出來就足以當作preliminary data了 04/20 06:12
16F：→ lail: ，我們以前paper revise的時候為了跟時間競賽都是全部的人下 04/20 06:12
17F：→ lail: 來分工 04/20 06:12
18F：→ lail: 其實reporter細胞也可能是實驗瓶頸啊，以前也遇過試了3-5種 04/20 06:15
19F：→ lail: 相關細胞，但是有點的根本沒反應，有點的反應不大，也花了 04/20 06:15
20F：→ lail: 不少時間 04/20 06:15
21F：推 gustpigex: 剩不到四週還要補ChIP..... 04/20 11:41
22F：推 ararthur: 即使是b大 不過reporter assay四週能完成嗎... 好想知道 05/11 14:52
前面提到共有6組wildtype/mutant片段，到今天算第4週
2週內，其中3組接好wt/mt clone並各別測試一次reporter
3週內，共5組接好wt/mt clone，但只有4組來得及比較reporter
4週內，讓這5組都至少進行過一次reporter或repeat
很可惜第3週結束仍有1組連wt片段的clone一直失敗
懷疑是整個genome不只一套同源序列，可能要重新設計primer配對
考量時間因素後這週就放棄了，反正已有5組可以交差
※ 編輯: blence (180.218.151.4), 05/11/2017 21:23:11