作者reborn54391 (小邱)
看板Biotech
標題[求救] Western 問題
時間Fri Apr 7 23:42:20 2017
大家好 最近試跑western出了一些問題
如下
beta catenin 92kDa
https://imgur.com/a/u79tJ
GAPDH 37kDa
https://imgur.com/a/Cfqd8
LC3 16kDa
https://imgur.com/a/Ryiqp
同一片膠
beta catenin 和 LC3 呈鋸齒狀
GAPDH 雖然沒有鋸齒 不過卻連在一起
不知道哪裡出了問題?
條件:
12% gel 0.75mm
sample loading量10~15ul
running 160V 10min 接著90V跑到底
transfer to PVDF 溼式 240mA 120min
麻煩大家了
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1F：→ xxtomnyxx: 第一次看到 stacking 跑的電壓比 separating 還高的！ 04/08 00:31
2F：→ xxtomnyxx: 你的 gel 應該是自己做的有分上下層的那種吧？ 04/08 00:33
3F：→ lail: 電流不穩?另外考慮蛋白質放少一點嗎?(你放多少 質量 的蛋白 04/08 01:05
4F：→ lail: 質，拜託不要跟我講體積) 04/08 01:05
5F：→ Ianthegood: 我也覺得是stacking跑太快而已 04/08 05:50
6F：→ roy047: 先慢後快 一開始60V而非160V才對 04/08 12:02
7F：→ reborn54391: gel是自己做的沒錯 蛋白量35ug 160V是參照前人的 04/08 18:08
8F：→ reborn54391: protocol 下次跑看看低電壓 04/08 18:09
9F：→ reborn54391: 感謝大家解答 04/08 18:12
10F：→ xxtomnyxx: 知道 Western gel 分兩層的原理的話，看到這電壓一定會 04/08 18:59
11F：→ xxtomnyxx: 覺得有鬼。台灣科學研究的基礎教育已死.... 04/08 18:59
12F：推 BGG: 要不要先瞭解原理，不是前人說的就是對的! 04/08 19:14
13F：推 cyc5566: 大推160V XDDDDDDDDDDDDDD 04/08 19:52
14F：推 tynse71864: 我有開160結果沒事耶 (掩面 04/08 23:13
15F：推 aaaazzzz: 哈哈,我也用過400V跑15min,驚覺這兩片膠比另外兩片膠快 04/08 23:17
16F：→ aaaazzzz: 趕快把速度調慢,不過那次效果還可接受(但後來還是不敢用 04/08 23:18
17F：推 syusuke12: 我下次也要試試看160V 04/09 13:16
18F：推 osla30: 普通膠跟普通Buffer，開超過200過，會很燙且冒煙 04/09 15:44
19F：→ osla30: 要高電壓要用特殊膠或特殊Buffer較沒問題 04/09 15:45
20F：推 taya1991: 一般是先慢後快+1 04/09 22:08
21F：推 taya1991: transfer部分再小心一下，別轉一般位移？ 04/09 22:10
22F：→ isu0911: 電壓太高造成溫度過高? 04/10 01:25
23F：→ QuTarh: 很危險 04/11 13:14
24F：推 smile07: 上膠電壓太快 一般都先慢在快 transfer buffer有沒有加me 04/16 01:33
25F：→ smile07: thanol 我忘記加過 跑出來好像也這樣 04/16 01:33
26F：推 bob79620: 我之前就是依照前人的方法也跑出波浪型的wb 然後被老板 04/18 16:04
27F：→ bob79620: 罵到臭頭 後來才發現前人的TEMED整整是別人的五倍 04/18 16:04
28F：→ bob79620: 改回原本倍數之後 就沒跑過波浪膠了 04/18 16:05
29F：→ LIAR: 高電壓的特殊配方式什麼啊？ 04/22 23:49
30F：→ xxtomnyxx: 廠商賣的 Bis-Tris-HCl gel 官方給 200V 50min， 04/23 01:57
31F：→ xxtomnyxx: 雖然也是可以買 Bis-tris 回來自己做，但 Bis-Tris 本 04/23 01:57
32F：→ xxtomnyxx: 身就很貴了......有錢人才能花錢換時間啊 04/23 01:58
33F：推 ko363630: 上膠我都用70跑。第一次看到160衝到底 04/28 21:05