作者kaofei (phoebe)
看板Biotech
標題[求救] 搖菌抽plasmid (large insert)
時間Fri Mar 17 11:51:59 2017
各位大大好
想請教一個狀況
我做5'RACE，用kit內附的in-fusion cloning kit塞了一個快8kb的insert進到pRACE vector內
vector本人約2.6 kb
之後transform到 Top10 competent cell然後塗盤、挑菌
2.5 ml LB+amp 搖overnight後限制酶切割有release出預期大小的片段
但plasmid 濃度很低，大概20-40 ng/ul吧 (picodrop感覺不太準)
會低於生技公司定序濃度的下限
於是我取35 ul的15% glycerol stock加入7.5 ml的LB+amp 在50 ml離心管中搖o/n
結果長超多，但汙染了...因為抽出來濃度還是很低
想請問
對於這種large insert長很慢的狀況
要收集到一定濃度的plasmid，放大volume去增菌的想法應該沒錯吧？
如此汙染的狀況會比較容易發生嗎？
我在思考哪個程序污染的時候，想到glycerol好像沒有無菌...
因為LB是新泡的，也是放涼後才加amp，自認應該沒有問題
那想請問如果Glycerol要變無菌，常用的方法有哪些？
好像不建議autoclave，但過filter感覺會天荒地老...
想說有沒有比較便捷的方式><
謝謝！
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1F：→ grox: 應該是混到雜菌 建議re-transform重新塗盤挑single colony 03/17 12:09
2F：→ grox: 再放大, 還有50% glycerol(glycerol+H2O)autoclave沒問題 03/17 12:10
3F：→ kaofei: 樓上的意思是，不是因為我insert太大所以長比較差? 03/17 12:25
4F：→ kaofei: 因為我最初挑single colony的時候，只要是陽性的就長很慢 03/17 12:26
5F：→ kaofei: 喔我懂你的意思了XD~~謝謝 03/17 12:27
6F：→ kaofei: 但我想請問，如果是50% glycerol用來做stock要多少比例啊? 03/17 12:28
7F：→ a90648: 我是1:1加啦! final 25% 03/17 13:27
8F：→ a90648: 不過我是用含50% glycerol的LB 03/17 13:28
9F：→ kaofei: 可否再請問large insert轉型的效率降低，是因為影響到菌 03/17 16:15
10F：→ kaofei: 的生長(菌量低)，還是因為她從high-copy變成low-copy? 03/17 16:15
11F：→ kaofei: 我一直以為是前者，因為搖菌(o/n)後總是相對清澈，但後者 03/17 16:16
12F：→ kaofei: 是否也有可能？如果是low-copy的plasmid，搖出來菌量多但 03/17 16:17
13F：→ kaofei: plasmid少是正常的嗎？因為之後也有可能用BAC就好奇問問~ 03/17 16:19
14F：推 Ianthegood: 可能啊 是說凍菌final 10%應該就夠了 03/17 18:16
15F：推 Ianthegood: 一般從stock拿菌建議摳摳塗盤 再挑single colony 你沒 03/17 18:17
16F：→ Ianthegood: 有把stock解凍吧? 03/17 18:17
17F：→ kaofei: 有耶~但我當初凍了兩管stock XD stock解凍不宜超過幾次嗎? 03/17 18:30
※ 編輯: kaofei (140.112.4.208), 03/17/2017 18:32:27
18F：→ Ianthegood: 一次都嫌太多... 03/17 22:28
19F：→ Ianthegood: copy number跟大小比較沒關 跟plasmid的ori有關 03/17 22:52
20F：→ kaofei: 所以如果plasmid用完了，通常寧可拿plasmid重新轉型?而非 03/18 08:58
21F：→ kaofei: 取Stock直接增菌嗎？還是挑stock的菌不需要解凍?沾一下塗? 03/18 08:59
22F：→ blence: 還沒定序,不知道要不要保存的plasmid,為什麼要凍stock? 03/18 09:37
23F：→ kaofei: 怕太晚凍會汙染...想說Glycerol便宜..真定序錯了在丟掉 03/18 09:42
24F：→ kaofei: 而且沒做過這麼大的insert...怕錯過任何陽性的colony XD" 03/18 09:45
25F：→ Ianthegood: 不用解凍 拿tip摳一點在plate上亂畫就好 03/18 19:08
26F：→ tynse71864: 我都挖一點丟 LB搖 (掩面 03/18 22:39
27F：→ blence: 還在plasmid check階段就每管mini凍菌不是更會汙染出錯嗎 03/19 00:21
28F：→ kaofei: 好像沒發生過這樣的問題所以沒有考慮過，只是俊放在4度C到 03/20 20:16
29F：→ kaofei: 到定序確認(一般要兩天時間吧)不擔心菌死掉或雜菌汙染嗎? 03/20 20:17
30F：→ a90648: 養的時候有加抗生素啦，另外菌沒脆弱到放個兩天就掛掉啦 03/20 21:35
31F：→ kaofei: 那那可以借問個問題嗎？如果Toxic insert想要在RT長，搖菌 03/22 15:43
32F：→ kaofei: 一般12-16小時，若RT或30度會搖多久？中途會要補抗生素嗎 03/22 15:45
33F：推 Ianthegood: amp比較麻煩因為他的resistance gene會吐到胞外, 所以 03/22 17:29
34F：→ Ianthegood: 我會建議starter culture如果養37要換medium再拉OD跟i 03/22 17:30
35F：→ Ianthegood: nduction. 低溫一點還有其他的antibiotics應該沒這個 03/22 17:30
36F：→ Ianthegood: 問題, 搖多久跟用多少iptg還請自己嘗試XD 03/22 17:30
37F：→ blence: 上面好像回錯了,應該是講下一篇的 03/22 17:50