作者yvette26 (小軒)
看板Biotech
標題Re: [求救] WB internal control 定量問題
時間Mon Mar 6 23:09:24 2017
前文刪光光
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1F：→ a90648: internal control會有變化的話就不能這當internal control 03/06 13:52
2F：推 huangsw: 先說你的材料來料是啥? 那你用595nm測的原因是? 03/06 14:22
3F：推 huangsw: 推a大的 internal control不應該有差異 03/06 14:36
我的材料來源是大鼠的脊髓，做的是有關神經損傷的部分，
因為在取sample的時候，每隻不可能取到一樣重的脊髓，
所以如下blence所說，之前學的都是前定量，用595 nm波長去測OD值，推算回蛋白濃度。
我知道理論上internal control是要夠準才能當internal control，
但是我從一開始的sample量就不會一致了，
所以...後定量也是可行的?
推
qiet: 第一次聽到有人這樣算, 不覺得很浪費時間嗎, 要跑兩次膠ㄟ 03/06 16:43
4F：→ tz2733: 你有找到一篇paper是這樣寫就知道可不可以啦~ 03/06 18:05
paper好像都不會寫到如此詳細的步驟...
5F：推 darrenyo: 不管怎樣在正常情況下你的Data的 internal control 03/06 18:19
6F：→ darrenyo: 都要一樣啊 所以理論上不管是用哪個方法最後結果都一樣 03/06 18:20
7F：→ darrenyo: 只是你定量可以訂的準的話就不用多跑一次啦 03/06 18:20
8F：推 darrenyo: 只是不太懂你測595nm是? protein assay的結果嗎? 03/06 18:23
9F：→ Ianthegood: 595是bradford吧 03/06 18:35
10F：推 Ianthegood: internal control不是本來就該當作standardisation? 03/06 18:40
11F：→ Ianthegood: 不然你在paper裡看到每個lane的actin一樣粗是怎麼做 03/06 18:41
12F：→ Ianthegood: 的? 03/06 18:41
13F：→ blence: actin一樣粗有不同方法阿,前定量-assay OD;後定量-試跑膠 03/06 18:47
14F：→ blence: 或者複製貼上(誤)；一般都是採前定量,而不是原po的後定量 03/06 18:47
所以這兩種的確都是通行的定量方法?
15F：推 tz2733: 好奇原po說的這種方法 第二次跑出來的internal control真 03/06 20:55
16F：→ tz2733: 的會一樣嗎? 03/06 20:55
目前看來是差不多的。
17F：→ Ianthegood: 就試跑當作前定量囉 應該真的會一樣粗吧 03/06 21:05
18F：→ raiyu: 有聽過 前助理他碩班的實驗室是這樣"定量"的 (雖然我覺得有 03/06 21:26
19F：→ raiyu: 點...作假的感覺...我個人感覺啦 03/06 21:27
20F：→ Ianthegood: 怎麼會 都是在算target protein跟standard的相對量啊 03/06 21:36
21F：→ Ianthegood: qPCR不是也這樣算 03/06 21:36
22F：→ raiyu: 定"蛋白"跟定"圖片"的差異 呈現的結果可能一樣但定義不同03/06 21:51
我就是不確定如此，因為雖然結果可能一樣，但定義不同。
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 59.126.51.113
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※ 編輯: yvette26 (59.126.51.113), 03/06/2017 23:11:21
23F：→ a90648: internal control就是會跟著你的組織量多就多少就少 03/06 23:23
24F：→ a90648: 才叫做internal control啊! 03/06 23:23
25F：推 a90648: 舉個例子semi-qPCR 不就是跑膠根據 internal control 03/06 23:29
26F：→ a90648: band的強弱進行調整嗎? 03/06 23:29
27F：→ a90648: 照你的說法，以前paper上用semi-q的都有問題囉? 03/06 23:31
不好意思...我沒有做過semi-qPCR...所以這段例子我真的看不懂...
28F：推 hsnuyr: 我覺得問題在所選的internal control是不是真的不會隨著 03/06 23:49
29F：→ hsnuyr: 實驗條件變化 03/06 23:49
30F：→ a90648: 沒錯!! 能這樣做的前提就是在這邊 03/06 23:51
31F：推 hsnuyr: 我們就有實驗同一個sample同時壓GAPDH和tubulin結果卻不一 03/06 23:52
32F：→ hsnuyr: 樣，所以使用後定量的前提我覺得是要先能證明使用的intern 03/06 23:52
33F：→ hsnuyr: al control真的不會隨實驗變因而變化 03/06 23:52
34F：→ hsnuyr: 但是這樣很辛苦就是，學弟妹被我要求一個sample要跑三種in 03/06 23:53
35F：→ hsnuyr: ternal control哈哈哈 03/06 23:53
36F：→ a90648: 這算是很嚴謹的做法啦XD 03/06 23:54
37F：推 darrenyo: 所以你先定量完下去跑的結果internal control到底一不一 03/07 00:53
38F：→ darrenyo: 樣啊? 03/07 00:53
啊，我忘記補充了，
這兩種方法操作下，跑出來的internal control都是差不多的。
※ 編輯: yvette26 (59.126.51.113), 03/07/2017 03:00:16
39F：→ a90648: semi-q 簡單來說就是cDNA pcr完之後跑膠,根據internal con 03/07 09:09
40F：→ a90648: trol的強弱來調整pcr cycle數，將大家internal control調 03/07 09:09
41F：→ a90648: 成一樣強來比較target gene表現量的多寡 03/07 09:09
42F：→ yvette26: 感謝a90648~ 03/07 13:13
43F：推 darrenyo: 那如果這樣我認為用你原本的方法就好 沒必要多跑一片膠 03/07 23:43
44F：→ darrenyo: 但是就如同其他版友討論第二種方法也沒甚麼不對 03/07 23:44
45F：推 darrenyo: 有些時候某些樣品會遇到定量定不準的狀況.. 03/07 23:48
46F：→ darrenyo: 就可能可以考慮用第二種方式 03/07 23:48
47F：→ a90648: 基本上該說的大家也說得差不多了，而原PO也說了兩種做法 03/09 00:10
48F：→ a90648: 得到的結果是差不多的，後定法是否真的有問題 03/09 00:11
49F：→ a90648: 就讓大家自己做判斷了 03/09 00:11
50F：→ a90648: = = 推錯篇... 03/09 00:12