作者tynse71864 (TATA box)
看板Biotech
標題[求救]
時間Sun Mar 5 18:34:21 2017
各位好， 手機排版請多見諒:
想請問有沒有做過 cell fractionation的實驗的版友呢?
由於 lab無人做過， 因此是自己按文獻的步驟進行 :
我的實驗有 wt跟 ko組， 想比較ko A蛋白後對於B 蛋白 (在 ER及 Gol)內的影響, 有試過 sucrose/optiprep gradient
這邊是材料與方法:
1.收集老鼠的小腸細胞於PBS中
2.將細胞以10mM HEPES,pH7.4 進行swelling (冰上5分鐘
3.加入2X的lysis buffer (最後濃度為10mM HEPES,250mM sucrose, 1mM DTT, protease inhibitor (1XPI)
4.使用tight-fit dounce homogenizer 磨30下 (冰上,約5分鐘)
5.cfg 1900g 10min (離掉unbroken cell跟核)
6.取上清, cfg 100000g 1h
7.此時上清應為cytosol protein, pellet為microsome (ER/Gol等)
8.將pellet 溶於250mM sucrose 中 (含10mM HEPES,1mM DTT, 1XPI),並滴於20~56% sucrose gradient上
9.cfg 39000rpm 18h (rotor:SW41Ti)
10.由上至下以pipetman取1ml,收集12個fraction
11.取部分做western blot, 並壓ER/Gol的 marker
目前的問題是， 我的 ER 跟Gol兩個部分分不開， 導致我無法比較兩者之間的差異
(按照文獻,Gol 約 fraction# 3-5, er# 6-12; 但我的做出來總是gol# 3-6, er 2-12)
https://goo.gl/Z5yRzd
(圖中我的gol還是會到後面...但大部分都在45之間,後面幾次實驗 Gol就比較集中在4~5
可ER每次都會從2~12)
已經試了快半年了仍然沒什麼進展， 也已經向不同 protocol的作者詢問細節，
仍然是無法解決， 因此想上來問問是否有做過類似實驗的版友可提供意見呢? 謝謝!
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1F：推 alaric: 先找你的指導教授討論吧. 找人檢查你的方法流程. 03/05 21:56
老闆本身沒有做過相關實驗;我跟他討論了很多次,也試了6次左右,仍無法解決
我有跟做類似實驗的國外作者們通信過, 給的資訊有改善部分結果
2F：→ Ianthegood: 然後你的方法材料都不明不白 板友如何隔空抓藥 03/05 22:32
抱歉發文當時無資料,已補上
3F：推 Ianthegood: 首先是你壓的marker跟作者的不一樣啊 cnx那隻的signat 03/06 01:38
4F：→ Ianthegood: ure就差沒有太多 然後你如果要看兩個胞器內的差異你就 03/06 01:38
5F：→ Ianthegood: 抓幾個最純的fraction同時壓你的protein還有golgi跟er 03/06 01:38
6F：→ Ianthegood: 的marker當作standardisation就可以了吧 03/06 01:38
7F：→ Ianthegood: 要收到純的胞器可以說是不可能 03/06 01:39
Syntaxin6是家裡剛好有順便壓一下
MTP在原文獻中也是作為ER marker (位置同GRP94)
https://goo.gl/eUUhp6
這是其他次實驗的結果
應該說我的實驗結果會飄...也無法像paper一樣分的那麼好
8F：推 Ianthegood: 因為dounce本來就是irreproducible啊XD 加上你samplin 03/06 18:32
9F：→ Ianthegood: g用pipet 我們家在分gradient都用快停產的機器在分才 03/06 18:32
10F：→ Ianthegood: 能ensure reproducibility 03/06 18:32
我知道有蠻多用nitrogen bomb,但也是很大部分用Dounce?
我們家是有分gradient 那台機器, 只是管子必須用polyallomer的
目前手上全都是ultra clear戳不了洞QQ
※ 編輯: tynse71864 (203.71.62.165), 03/07/2017 11:40:03