作者helen82323 (弦)
看板Biotech
標題[求救] internal control band粗度差很多
時間Thu Feb 23 13:05:28 2017
抽活體組織蛋白質，也用BCA測濃度，但是每次跑western的internal control都不是一樣
粗
我是做不同發育時間點的該組織表現量，然而每次都是發育早期的兩三個時間點internal
c
我用的control是B-actin
補充一點，因為被這個問題困擾很久，有測過用lysis buffer稀釋sample和用ddH2O稀釋s
am
我的sample是WT，沒有任何處理
請問這個問題要怎麼解決？？？
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.4.206
※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1487826331.A.DF3.html
1F：→ Bows: 換一個internal 試看看02/23 13:28
2F：推 darrenyo: 簡單敘述一下從抽蛋白質到跑Western前的Sample處理?02/23 16:34
3F：→ darrenyo: 這樣大家比較好幫你看看是不是哪裡有問題?02/23 16:35
4F：→ Ianthegood: data永遠是對的02/23 22:11
蛋白質是用lysis buffer抽的，proteinase inhibitor都是現加，抽完放冰上十分鐘，4
度C
測濃度是將蛋白質用lysis buffer(現在改用ddH2O)做25倍稀釋，然後用BCA的kit測，根
據?
western的步驟我也說一下：每一個well load 80ug的蛋白質+10uL深藍色臭臭的buffer，
膠
真的不知道差異是哪一步造成的，已經做了好多組都是這樣，而且sample算珍貴，如果換
in
※ 編輯: helen82323 (118.160.92.128), 02/24/2017 00:46:24
5F：推 Bows: internal 雖然是穩定表現，但在某些極端條件下還是會跑掉02/24 02:11
6F：→ Bows: 先確定不是internal表現跑掉的問題吧02/24 02:12
7F：→ Bows: 如果是就一定要換了02/24 02:12
8F：推 tz2733: 在發育時間較晚的sample 因其他非actin蛋白產量變多了02/24 11:00
9F：→ tz2733: 所以測濃度loading等量蛋白跑膠後 actin比較淡(佔比少)02/24 11:00
10F：→ tz2733: 不是正常嗎? 純粹我的猜想02/24 11:00
11F：→ Bows: .....如果是本身actin在前後期會改變表現量那就代表actin在02/25 02:21
12F：→ Bows: 這裡是不能當作internal即使你硬是自己亂調，得到的結果也是02/25 02:21
13F：→ Bows: 假的，還在那裡糾結全部重做？02/25 02:21
14F：→ Bows: 已經好聲好氣的說了，如果你不聽也沒人會想理你02/25 02:22
15F：→ Bows: 若是每次做的結果actin都是在某個時間點增加/減少，那你第一02/25 02:25
16F：→ Bows: 件事情必須是確認actin的表現量跟其他常見非細胞骨架的inter 02/25 02:25
17F：→ Bows: nal做比較，去確定actin是否為穩定的internal02/25 02:25
18F：推 elelith: 不同發育階段的internal control表現不一樣很正常...02/25 07:47
19F：→ elelith: 如果你是要量化 試試用ponceau然後用整行(total loading)02/25 07:48
20F：→ elelith: 去normalize02/25 07:48
21F：推 Ianthegood: 他都先用loading量normalise了啊02/25 19:54
22F：推 tynse71864: 我同意 ele大的做法～ 做完 wb後用立春紅染一染看總蛋 03/02 19:17
23F：→ tynse71864: 白量03/02 19:17
不好意思，實驗室目前沒有立春紅，但有需要的話會買。我想請問染立春紅後要如何定量
? 如何呈色讓機器能夠偵測? 真的不太懂..謝謝
※ 編輯: helen82323 (220.136.197.16), 03/07/2017 01:34:59
24F：→ Ianthegood: 把最上面那串western看完再說 03/07 20:22
我跟隔壁實驗室借GAPDH來測試了，原本的actin真的不適合在我的sample當internal con
trol，現在只能換internal全部打掉重來了，很多組sample都沒了要等老鼠，過去白白犧
牲了很可觀的時間跟老鼠，雖然很痛苦，但是找到問題癥結點真的是非常感謝各位的提點
。
※ 編輯: helen82323 (223.140.105.217), 03/07/2017 23:58:02