※ 引述《huangsw (Orz)》之銘言： : 43 : : 謝謝大大的建議 : : 因為是重複先前的實驗，所以會一直參考前人的做法 : : 我發現之前的學姊似乎沒有比較induction前後的差異，但是因為實驗室之前有純化過其他蛋白，所以大家都不懷疑這樣的induction條件，只擔心inclusion body是否產生，但是學姊之前的測試結果是沒有inclusion body，也能夠純化出蛋白 : : 如果說induction條件真的不好，我有甚麼地方能改進呢，畢竟IPTG濃度已經用到1mM了，感覺只能增加表達時間? 然後因為沒有inclusion body所以並不需要改變溫度? : : 不過說到底老師還是一直認為是清洗的步驟不好QQ~但我已經沒招了 : 前人種樹後人乘涼, 但是難免有種歪的時候, 導致後人被壓傷, 這在科科界時有所聞. : 另外, 操作的手法也有可能會造成差異. : https://goo.gl/zMzalH : 請看上面這張圖, 理想的induction(中文應該是誘導?), : 應該要可以達到這張圖Lane 1 2的樣子(未純化). : induction本身牽扯到細菌的生長與複製, 意味著可以改的地方也有很多. : 不僅僅是IPTG和OD=0.5~0.6這兩個條件而已, 其實溫度也可以改. : 但是在做這些事情之前, 我覺得還是要先確認一下這個菌株仍有大量表達的潛力. : 如果沒有, 又想把事情做好的話. 那就砍掉重練. : 先把現在BL21的plasmid抽出來, 定序一下, 確保nucleotide是正確的. : (如果你找的到DH5alpha的菌株也行, 通常都用這個保存plasmid) : 然後重新tranform(轉形)到DH5alpha與BL21 並且妥善保存. : BL21的部分, 從transform的塗盤中, 挑選數個候選人(candidate)進行表現量的測試. : 挑到產量好的, 再去做induction的測試 (搞不好這時候就不用做條件的修改了). : 先確認有大量表現, 版友才好繼續幫你抓藥. : 如果有不懂的地方, 多看看paper也許會看到有用的資訊. : Good luck. 謝謝大大們的建議，我已經開始進行有無induction的比較 我的認知是如果要增加表現量就是增加induction時間,IPTG濃度,表現溫度 其他條件的改變(譬如低溫長時間表現)只是要避免inclusion body的產生 不知道這個想法是不是錯的 plasmid的序列之前已經定過所以沒問題 然後BL-21挑表現較好的菌這步驟學姊做過，我目前是拿他挑的菌來用(約一年多前，都冰-80) 取菌方式是用tip沾一點丟入LB，保存的菌瞬間冰回去 還是其實菌並不能保存這麼久? 不過不管怎樣如果測試結果真的是無法大量表現 小弟會聽從建議打掉重練 --

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