作者cowmama311 (牛媽媽)
看板Biotech
標題[求救] mtt細胞存活率
時間Thu Jan 12 19:39:42 2017
各位大家好，我的實驗是利用牛耳朵細胞來做實驗，是利用荷蘭牛跟黃牛的耳朵，做熱處理再利用mtt來測存活率。
實驗的步驟是，細胞解凍後24小時就繼代，待細胞養到八九成滿後，接種到96well分別做兩種濃度 一個是十的五次方 一個是十的六次方
每孔加100ul，分三組
分別為控制組、熱處理12h、熱處理24h。
熱處理培養箱溫度為42.5 7%co2
同一時間接種完後先放38.5度 5%co2培養
培養24小時後先將熱處理24h移入熱處理培養箱
36小時候後將12h熱處理組移入熱處理培養箱
而控制組則是一直都在38.5度培養箱中。
熱處理完後倒掉培養液
三組於同一時間加mtt藥劑（1mg/L）每孔加50ul，放回38.5培養箱3小時，再取出倒掉mtt 藥劑在加入50ulDMSO搖晃10分鐘，在去測od值
可是測出來的存活率都是熱處理比控制組存活率來得高，問了老師老師只說是我們自己的問題，因為方法是學姐教我們的，我們也做了五六次了，數據出來都是這樣，也請學姐從頭到尾看一次我們實驗，也沒找出什麼問題，可是數據就一直都不能用…………懇請各位大大們幫幫我吧…
一直失敗感覺超級失落。。。。
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1F：→ raiyu: 那你用顯微鏡看實驗組細胞也比較多嗎? 01/12 19:55
2F：→ raiyu: 實驗組的溫度會不會影響粒線體的活性? 所以影響MTT結果 01/12 20:15
今天看過了 處理組跟控制組細胞看起來一樣多 哭
3F：→ Bows: 用手(計數器)算算看，若結果相同就是你們老師該去處理的事了 01/12 21:37
4F：→ Bows: 不是所有實驗都會如預想的結果一樣 01/12 21:37
5F：→ Bows: 若老師執意覺得是學生問題，那就塊陶阿 01/12 21:37
你說接種在96well裡頭做完處理後再把細胞打起來算細胞數？
6F：→ Bows: 除非有之前人有做過預期的結果 01/12 21:38
之前學長用tunel跑flow有跑出有差異 可是現在我們用mtt測就一直做不出來....
7F：推 tynse71864: 同 B大，後面學生推翻以前實驗室的結果不算不常見，尤 01/13 08:54
8F：→ tynse71864: 其當先前條件不 detail時 01/13 08:54
9F：推 tynse71864: 想問一下，有做 blank組嗎 (完全沒細胞的) 01/13 09:53
沒有耶 都是sample直接測
10F：推 satantaco: MTT因為跟粒線體有關 所以會有假陽性的可能 要排除 01/13 10:55
11F：→ satantaco: 必要時可能還是要計算數量來比對 或者再做LDH來互相比 01/13 10:55
再試這最後一次 希望老師會死心
大大還有推什麼比較簡單可以測存活率的方式嗎？
12F：→ satantaco: 照 才會精準 01/13 10:56
13F：→ raiyu: 測細胞存活率還有其他的實驗方法 01/13 13:50
有努力想讓老師換別種方式
14F：→ cowmama311: 感謝各位 目前老師還是想嘗試 他有更改一些試驗方式 01/13 16:54
15F：→ cowmama311: 增加三個控制組 分別為接種完24 36 48小時測 就 01/13 16:54
16F：→ cowmama311: 讓他弄最後一次吧 有跟別的老師討論過 外系老師想 01/13 16:54
17F：→ cowmama311: 法跟大家一樣 認為換個方法去測比比較好 但是我老師 01/13 16:54
18F：→ cowmama311: 執意要我再測一次 只好陪他試這最後一次吧 01/13 16:54
※ 編輯: cowmama311 (118.233.44.232), 01/13/2017 16:55:45
※ 編輯: cowmama311 (118.233.44.232), 01/13/2017 16:56:56
※ 編輯: cowmama311 (118.233.44.232), 01/13/2017 16:58:59
※ 編輯: cowmama311 (118.233.44.232), 01/13/2017 16:59:24
※ 編輯: cowmama311 (118.233.44.232), 01/13/2017 16:59:54
※ 編輯: cowmama311 (118.233.44.232), 01/13/2017 17:01:05
19F：→ blence: 細胞剛解凍,MT活性還沒回來,測MTT可能沒變化 01/13 18:16
20F：→ blence: per 96well可以放十萬,百萬顆? 牛耳朵細胞非常小顆嗎 01/13 18:16
21F：→ blence: 細胞多,final MTT濃度卻比常用的少幾百倍,以前都這樣做? 01/13 18:17
22F：→ blence: DMSO 50ul在96well在shaker應該搖不均勻,是用reader振的? 01/13 18:17
方法是學姐教的 這也是我一第一次做
因為學姐用豬耳朵細胞做有最出來
所以老師要我們也試試
關於要種的細胞數量 在下一次實驗我會試試種10000顆的看看
震盪的話使用這個
http://i.imgur.com/7L01yNI.jpg
23F：→ blence: 加MTT前是不是該讓各組細胞都回到同溫,反應效率才一致? 01/13 18:17
24F：→ raiyu: 另外 感覺你的細胞種得有點多+1 96well一般癌細胞我最多種 01/13 18:51
25F：→ raiyu: 1萬顆/well 做24hr 有時候細胞太多 生存條件不佳也有可能造 01/13 18:53
26F：→ raiyu: 成細胞死掉 01/13 18:53
27F：→ raiyu: (對實驗設計小小建議) 2組的溫度差其實不大 培養箱溫度並不 01/13 18:57
28F：→ raiyu: 是這麼準喔 01/13 18:57
29F：推 darrenyo: 最多10000 +1 01/13 23:23
30F：推 cyuchien: 總共要養3天。會不會像樓樓上說的，控制組細胞太多有些 01/14 19:19
31F：→ cyuchien: 爆掉了。 01/14 19:19
32F：推 aaa111bb2: 怎麼不做positive control? 01/15 17:42
？？？？
33F：→ e104582001: 96 well 1000000顆 太多了啦，20000~100000基本上多 01/15 18:42
34F：→ e104582001: 樹細胞都會太滿了 01/15 18:42
※ 編輯: cowmama311 (118.233.44.232), 01/15/2017 23:25:16
※ 編輯: cowmama311 (118.233.44.232), 01/15/2017 23:26:37