作者virusgg (kiwivivi)
看板Biotech
標題[求救] WB壓片很糊
時間Sat Dec 10 02:33:01 2016
請問大家
這週我做WB的時候跑SDS都很順利，Maker都很清楚。
可是tranfer完後小分子maker就糊掉了。
壓片後70kDa以上也都糊了，但是actin卻還可以，請問這是那個環節出問題?
http://i.imgur.com/C93sjZY.jpg
http://i.imgur.com/hyp3pLl.jpg
跑的條件
12%gel
65v 15min 115v 到10kDa到底
pvdf膜先泡甲醇活化
黑色) 一片海綿一片吸水紙 膠 膜 吸水紙 海綿
轉的是400mA 80分鐘
800ml tranfer buffer+200ml methanol
拜託各位大大了!!!!
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1F：→ blence: 附圖沒marker看不懂 12/10 09:33
2F：→ blence: 每個size都有最適合的gel%,如果%過低,actin也是會糊掉的 12/10 09:37
上圖是actin 43的
下圖是parp 89/116
3F：推 tynse71864: 咦你只有一片吸水紙？ 不是兩片嗎 12/10 13:06
我這次只放一片，比較薄，之前用原場的比較厚所以都用一片。
4F：推 lail: 70kd可以跑10%，比較美 12/10 15:14
謝謝^^本來要同時壓17的 所以用12% 是否有點太貪心XD
5F：推 tz2733: 看不太懂問題 是指小分子跟70kDa以上都糊 只有actin(42左 12/10 22:42
沒錯沒錯，就是這樣。
6F：→ tz2733: 右)是正常的 這樣嗎? 12/10 22:42
7F：推 iyorain: 給你參考~60v跑1hr 100v跑2.5hr 注意保冷 小分子跑比較久 12/11 01:07
8F：→ iyorain: 過熱膠會溶掉 transfer 180ma 80分鐘 12/11 01:07
感謝! 跑膠的條件試試看，可是有個小疑問180ma ??
※ 編輯: virusgg (223.138.64.86), 12/11/2016 08:37:41
※ 編輯: virusgg (223.138.64.86), 12/11/2016 08:38:43
※ 編輯: virusgg (223.138.64.86), 12/11/2016 08:40:15
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※ 編輯: virusgg (223.138.64.86), 12/11/2016 08:42:59
9F：→ blence: 如果會過熱溶膠請檢查一下buffer,因為比原po更長的條件我 12/11 09:37
10F：→ blence: 們都在用,另外"小分子跑比較久",這應該是寫錯了 12/11 09:43
11F：推 tz2733: 作膠時下膠底部有時會有很小氣泡 仔細看才看得出來膠有點 12/11 11:09
12F：→ tz2733: 波浪狀 所以跑到太底部的話小分子蛋白就會歪七扭八的 然 12/11 11:09
13F：→ tz2733: 後12%同時看你要的大中小分子是ok的 猜測是否transfer時 12/11 11:09
14F：→ tz2733: 膠融了? actin 看起來ok只是因為它量多......只是猜測 12/11 11:09
15F：→ tz2733: 給你參考 12/11 11:09
16F：推 tynse71864: 12%膠應該沒問題 我可以從17壓到120 12/11 15:51
17F：推 htLiu: 可能是Transfer時溫度太高 12/13 12:21
18F：推 biotip: 看起來可能是1抗體專一性問題2定量未準確3蛋白質可能表現 12/13 16:14
20F：推 iyorain: transfer時我不會調那麼高~會低於180mA 12/13 20:15
21F：→ virusgg: 發現溫度偏高就會開始糊，在跑SDSPAGE的時候，就發現make 12/14 12:09
22F：→ virusgg: r糊了，60v 20min 110v 95min。 12/14 12:09
24F：→ virusgg: 大家若遇到壓出來，有的很乾淨有的很髒，明明操作都同時 12/14 12:26
25F：→ virusgg: ，且髒的還沒有要的band會先 12/14 12:26
26F：→ virusgg: 1.一抗比例調高 12/14 12:26
27F：→ virusgg: 2.wash時間加長為一小時，10分鐘換一次 12/14 12:26
28F：→ virusgg: 3.換抗體 12/14 12:26
29F：→ virusgg: 4.先去大吃一頓再說...== 12/14 12:26
30F：推 tz2733: 跑膠就溫度太高 請確認你的running buffer及膠配方 有沒 12/14 18:19
31F：→ tz2733: 有錯 這電壓條件跑膠應該ok 12/14 18:19
32F：→ virusgg: running buffer是買的，不會錯吧== 12/14 19:11
33F：推 tz2733: 稀釋倍數錯誤也是有可能發生的呀~~ 12/14 20:16
34F：→ roy047: 同意樓上, 10倍稀釋有時變成9倍, 11倍稀釋之類QQ 12/15 03:07
35F：→ blence: 自行google會看到running buffer真的有兩種,主要差異在 12/15 11:38
36F：→ blence: glycine,分別是192mM與250mM 12/15 11:38
37F：→ virusgg: 謝謝大家，那天要稀釋20x running buffer時特別觀察一下 12/21 23:38
38F：→ virusgg: ，竟然發現放在下層4℃冰箱中的buffer 結冰了== ，結了 12/21 23:38
39F：→ virusgg: 一層冰，看建議儲存是4℃~25℃，我還放蠻底下的冰箱門邊 12/21 23:38
40F：→ virusgg: 。所以果然是稀釋倍率問題。 12/21 23:38