小弟我不算分生新手 該知道的基本操作步驟都知道 碩士期間開始接觸plasmid construct 剛開始做初期成功率也有60% 後來當了三年多助理 construct plasmid成了一個很基本的技術 挑的clone成功率90%以上很正常 幾乎沒有重做三次內做不出來的construct 我這一年多來換工作後 construct非常不順利 連TA cloning成功率也很低 常見的狀況是 transform隔天single colony很多 常常破百 可是 用restriction enzyme切 大小總是不符預期 重做5次 挑了50個colony 90%的pattern都一樣 切出來pattern可以再現 但都不對 ex: 我預期切出來是3.1 kb + 1.0 kb 可是切出來90%都是3.5 kb + 0.6 kb 甚至發生總大小比預期大的狀況 ex: 預期plasmid最後是7.3 kb 卻看到7.0 kb + 1.5 kb 定序結果都不對 或者enzyme切出來不對 colony PCR結果 90%的clone band卻正確 可是定序一樣不對 因為我不是新手 碩士畢業 又有三年多實驗室助理經驗 這種基本實驗卻一直失敗 過去一年來construct成功率只有一成左右 可是我同事們都很順利 很少發生重做三次內沒成功的狀況 讓我壓力很大 我跟主管 同事請教過 試過很多方法 https://www.neb.com/tools-and-resources/troubleshooting-guides/troubleshooting-guide-for-cloning 這類troubleshooting的資料也看不少 譬如ligation 加PEG3350 (final concentration 7.5%) 用commercial competent cell, RecA1 (抑制DNA recombination) http://download.rbcbioscience.com/HIT%20Competent%20Cells/Competent%20Cells/HIT-21/HIT-DM.pdf 我是用HIT-DH5alpha 一年過去了 還是沒什麼改善 進度緩慢 壓力很大 歸納常見狀況 1. 轉型順利 single colony很多 常破百 但enzyme切出來結果不對 2. 我用只有insert上才有 vector沒有的切位 enzyme可以切出band 推測insert有接進去 但大小不對 想請教各位是否可以給我什麼建議 提醒我其他該注意的細節 謝謝 --

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