作者tynse71864 (TATA box)
看板Biotech
標題[求救] 小鼠腸道組織研磨
時間Thu Oct 13 22:59:58 2016
版友們晚安
最近要將小鼠的小腸上皮細胞 (IEC) 做均質化
之後要上超高速離心 分出ER與Golgi
然而最近卡在細胞無法打破的窘境
幾乎8~9成的protein都在unbroken pellet中
因此來求救
均質方法:
IEC先以swelling bfr [10mM HEPES +1xPI (protease inh)] 5min
再加入2x的homogenize buffer (10mM HEPES, 150mM sucrose, 0.5mM DTT, 1x PI)
此處我試過用Tight Dounce homogenizer 30次或是30G 針頭 30次
磨碎後離心 分出pellet 與sup
再取相同比例做western blot
(以Calnexin做ER marker/GM130為golgi marker)
大部分蛋白都在pellet中 並沒有被打破
[有以Huh7 cell line 當作技術練習
一樣的方法下 大部分的蛋白都會跑去sup 留在pellet的很少]
希望有類似實驗的版友們能提供些建議了 謝謝!
PS: 有找過paper 會使用nitrogen cavitation bomb來破細胞
但周遭的實驗室都沒有這個儀器... 想請問有人使用過嗎?
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1F：→ sunorange: 可以先用液態氮磨過再抽 10/14 20:47
怕LN會把我要看的胞器都爆開了...
※ 編輯: tynse71864 (36.228.136.225), 10/14/2016 22:36:00
2F：→ signo: 舉手.要不要試著將脹破細胞的時間延長?另,離心轉速不行太高 10/23 01:49
3F：推 hypocrisyha: 不好意思請問樓上轉速大概要多少呢？(剛好也遇到同 10/24 21:09
4F：→ hypocrisyha: 樣問題QQ 10/24 21:09
5F：→ signo: 用過500g來分未破的細胞+核,但分的目標不同,buffer也不同.. 10/25 00:31
6F：→ tynse71864: 我以為這篇沒人回了@@ 我猜那個10k*rpm是要快速把細 11/05 01:50
7F：→ tynse71864: 胞離下來 (怕低速時間太久會破太嚴重 11/05 01:50
8F：→ tynse71864: 我後來試過10-15分鐘 (看起來)沒問題 15之後我的 gr 11/05 01:51
9F：→ tynse71864: adient分層會開始模糊 11/05 01:51