作者aaaazzzz (找英文家教)
看板Biotech
標題[求救] 請問大家多用哪一家polymerase?
時間Fri Sep 30 18:05:36 2016
想請問大家在construct基因的時候，
通常是用哪一家的牌子可以得到非常低的錯誤率?
最近在做一個約3K的基因，
要將其塞入pCMV-2A的質體，
花了快三周的時間確定整段序列正確(已經將整個CDS分四段定序完成)，
下一步做了八種不一樣的點突變，
原本只定序突變的位置，
(因為一次定序約800-1000bp，保守是600bp)
有同仁建議還是整段定序比較好(整段定序就要多花三倍的錢)
結果定序結果出來八個序列有三個出現各一到二個胺基酸(胺基酸真的改變)錯誤，
學理上可能不影響我的實驗結果，
但為了科學的真實性，
我還是又花了一周多的時間重作，
結果錯誤的三段裡面，
其中有二段基因還是錯誤，
而且錯的地方跟我第一次錯的地方不一樣，
因為定序是委託基龍..做的，
有爬過文，
看大家對他們的家的primers不大滿意，
所以我想是不是定序出現錯誤，
就在附近設計另一段倒回來的primer，
結果定序跟前一次相同(表示定序應該是OK的，訊號非常明確)
我使用的polymerase是NEB的Q5 DNA Polymerase，
業務跟我說是市場上最佳精確度，
比別家正確率高很多，
另外Pfu錯誤率為1/130,0000，
以我約3kb的大小，
錯誤率低於1/400，
但我這系列重組約14段(單一或數個點突變)，
其中有五段有問題，
出錯的機率也太高了！
不曉得各位版友，
大多使用哪家的Pfu來construct，
謝謝！
附註：我使用60度，30cycles，其他比例依照原廠(NEB)提供
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1F：→ Bows: 你有看基米的定序圖嗎，有時候是他從pick轉文字會有錯 09/30 18:12
2F：→ Bows: 我基米的定序有錯會再去對pick 09/30 18:12
3F：→ aaaazzzz: 有看,波型很明確(沒有雜band,也不是很多的A or T or C 09/30 18:19
4F：→ aaaazzzz: or G疊在一起,而且錯的地方離primer約3-400bp，所以也不 09/30 18:20
5F：→ aaaazzzz: 是因為定序的尾巴或頭造成的錯誤(指訊號不穩定) 09/30 18:20
6F：→ blence: 除非seq比較怪,我覺得不應該會有突變,另外錯誤率1/400不是 09/30 19:10
7F：→ blence: 這樣算的 09/30 19:15
8F：→ aaaazzzz: 回b大，我一開始也以為我原本突變的點成功就好了(那附近 09/30 21:34
9F：→ aaaazzzz: 的序列也正確)但沒想到多訂頭尾之後,出現不同位置的錯誤 09/30 21:34
10F：→ aaaazzzz: 有一次還由TCA出現TAA(stop codon，那當然要重做)的突變 09/30 21:38
11F：→ aaaazzzz: 還有一般觀念說Taq錯誤率高，但沒想到我用了具有Pfu功能 09/30 21:40
12F：→ aaaazzzz: 的polymerase，錯誤率也高得離譜，正準備向別家購買 09/30 21:40
13F：→ blence: 你如果用site-direct方式做,30cycle也太多了 09/30 22:33
14F：→ aaaazzzz: 沒錯，我是用site-directed mutagenesis，一開始先設計 10/01 00:38
15F：→ aaaazzzz: 兩段部分互補的序列(包含我想要突變的部分),P了30cycles 10/01 00:39
16F：→ aaaazzzz: 之後,兩段使用1:1當成模板,再用頭尾的primers,再P 30 10/01 00:40
17F：→ aaaazzzz: cycles，所以b大建議我調低cycles數？但先前用25 cycles 10/01 00:41
18F：→ aaaazzzz: 來P，看起來band很微弱 10/01 00:42
21F：→ blence: 多了10cycle就1000倍了,你的長度又達3k,很難不會有突變 10/01 00:50
22F：→ blence: 去增加template,或參考先前文章調整reaction或primer 10/01 00:56
23F：→ xxtomnyxx: 就我所知，Q5是當今排名第二，第一是Platinum SuperFi 10/01 02:04
24F：→ xxtomnyxx: ，Phusion排第三，不過SuperFi和Phusion都能 1kb/15s， 10/01 02:05
25F：→ xxtomnyxx: 而且還有dsDNA binding能讓Tm提高，所以我比較推這兩個 10/01 02:06
26F：→ xxtomnyxx: 然後我如果做template是plasmid的PCR，我都加已純化的 10/01 02:07
27F：→ xxtomnyxx: plasmid 500 ng/ 100 uL PCR reagent然後跑25 cycles， 10/01 02:08
28F：→ xxtomnyxx: primer也都下最高濃度F和R各 1 uM。 10/01 02:09
29F：推 hitmd: 可與該區業務聯繫，請公司幫你抓問題點 10/04 12:13
30F：→ aaaazzzz: 感謝b大與x大回覆，我再試試看25cycles效果如何 10/18 18:47