作者kaofei (phoebe)
看板Biotech
標題[求救] 用Oligo dT跟一Forward primer取代3' RACE
時間Sun Sep 4 17:17:11 2016
大大們好：
想請問有人有用過oligo dT跟Sequence裡的forward primer去跑PCR
夾出用oligo dT轉出的cDNA(RNA有poly A tail)嗎
會這麼做是有點想避開3' RACE，而且實驗室有人有成功過(雖然是不同的RNA)
不知道有沒有經驗可以分享一下
我之前做常會遇到well很亮，但沒有band的情形
用了hot start
步驟大概是：
PCR mixture (GeneDirex HiFi系列) without polymerase 95度C 4 min後迅速放回冰上
再把polymerase加進去，然後on一般的program (initial denature, denature...)
結果well卡章的情形有好轉，目標band也慢慢出來了，只是亮度都很淡而且有雜band
所以就提高了annealing temperature(55-->60)，雜band有減少，但目標band還是不亮
因為實驗需要定序RNA的全長，這個片段需要被Clone出來
希望PCR product的量能多一點
不知道有沒有人有甚麼方法可以幫忙改善這個情形
或類似經驗可以分享的，謝謝！
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※ 編輯: kaofei (140.112.96.149), 09/04/2016 17:17:54
1F：推 jabari: RACE就多屁股的Anchor而已...多跑一圈乾淨很多 09/04 23:09
2F：→ jabari: 況且你都用Hifi在跑了 多跑一次跑嘛跑嘛 09/04 23:11
3F：推 Ianthegood: 推樓上XD 09/05 00:09
4F：→ Ianthegood: 或是多換幾種polymerase跑啊 有時候便宜的才跑得出來 09/05 00:11
5F：→ kaofei: 了解，所以不用擔心多跑一次序列可能出錯嗎?或者HiFi超威? 09/05 00:18
6F：→ kaofei: 還是因為我要先切膠純化的關係@@"，這樣是不是會比較保險 09/05 00:18
7F：→ Ianthegood: 只要你的error rate<10^-4 第一次做錯的在第二輪會被 09/05 00:47
8F：→ Ianthegood: 稀釋到不見 就切正確的size多挑幾個clone定序囉 09/05 00:48
9F：→ xxtomnyxx: 我想問問你為什麼會想避開 3' RACE ? 09/05 00:50
10F：→ kaofei: 主要是如果這樣做得出來，就不用再多買個kit，單純經濟些 09/06 09:03
11F：→ kaofei: 沒甚麼太厲害的理由其實XD" 09/06 09:04
12F：→ xxtomnyxx: 咦？不是只要多訂一條帶有 adapter 的 dT primer 嗎？ 09/06 10:58
13F：推 jabari: 3'race不用kit...上網找manual, 定primer 就好 09/06 13:58
14F：→ kaofei: XD" 了解，抱歉學藝不精，會再努力的，謝謝！ 09/06 15:31
15F：→ Ice9: 目標產物有多長？會不會有 isoforms? 09/06 18:44
16F：→ kaofei: 大概1600 bp，isoform是指@@"...抱歉這部分還沒很了解orz 09/06 21:24
17F：→ xxtomnyxx: 你去 NCBI 找你的目標基因(記得選對物種)點進去看， 09/06 22:02
18F：→ xxtomnyxx: Genomic regions, transcripts, and products 欄位如果 09/06 22:02
19F：→ xxtomnyxx: 你的基因有超過一條線，就是有 RNA isoform 09/06 22:02