大家好 本板首Po，如有觸犯板規還是甚麼的請盡速通知謝謝 最近做Western老是有時候做得出來有時候又做不出來(明明是同一個sample) 做pull down的Western明明沒問題，跑細胞protein的Western卻老是出問題 困擾我很久所以想請問大家是不是我哪裡有出問題 原本跑出來是這樣http://imgur.com/nxJszRV 或這樣http://imgur.com/aY92h4A Myogenin和FLAG算是有符合預期 但定量不怎麼對所以又跑了好幾次 但最近老是跑成像這樣http://imgur.com/tEqoZxd 想請問大家我是不是有哪裡出問題 流程列在下面了，想請大家幫我看一下，謝謝！ --------流程開始------- 收cell protein是用1x DPBS wash兩次後 加入RIPA buffer (含0.1% SDS, 1x protease inhibitor, 1x phosphotase inhibitor)後 用1000 μl的tip刮破細胞後收lysate，4℃ 全速離心半小時後取上清液 測OD595算濃度後取50 μg(用二次水或RIPA buffer補到每個sample體積一樣)和4x sample buffer混合 92~95℃煮5分鐘後用100 V跑SDS-PAGE Transfer是使用半乾式transfer 我Transfer前先讓PVDF membrane浸泡在methanol至少1分鐘、 厚片濾紙及gel浸泡在1x transfer buffer 先將濾紙放上正極板上，再依序放PVDF membrane、gel、濾紙疊上並擠掉氣泡 (多的transfer buffer用割stacking gel的那個綠色塑膠片塗平在正極板上) 用10 V, 200 mA跑1.5小時 (因為要transfer 2片gel所以用200 mA) 跑完後依marker將預期位置的PVDF割下來放入塑膠盒， 用5 % BSA (以1x TBST配置)進行blocking，室溫1小時 1小時後blocking倒掉先加5 % BSA，再加入一抗，4℃ o/n 隔天再拿出來室溫1小時 (學長說有的抗體還需要這步驟讓其binding更好還是啥的) 用1x TBST wash 3次，每次10分鐘 倒掉1x TBST後先加入1x TBST，再加二抗，室溫1小時 再用1x TBST wash 3~4次，每次10分鐘 PVDF放擦手紙上使其稍微乾一點後用配好的ECL反覆淋5次以上 放擦手紙上使其稍微乾一點後放到底片夾的透明膜裡去暗房壓片 -------流程結束------- 其實我個人猜想是不是transfer出問題，但問學長他不認為是transfer的問題 關於transfer另一位學長說只需要定電流即可(一片gel用90 mA for 2 hrs，兩片則電流加倍以此類推)，他說因為電壓會隨buffer加的量而有所不同 我只定電流幾乎做不出像上面第一張圖或第二張圖那樣 (但pull down我只定電流都沒問題，有觀察到只定電流電壓會升到10~15 V) 帶我做實驗的學長卻連電壓一起定，每次我都有觀察到電壓一到10 V後電流就開始往下掉，但他說電壓有到就好了，有時候這樣就做得出來 我看網路上教學影片還有看到把正極板上的buffer吸乾而不是像我們這樣塗平的，然後他是定電壓 想請問半乾式transfer到底哪個做法才對？ blocking用BSA或脫脂奶粉好像也沒影響 另外想請問抗體是否也可能影響結果？ 像我問學長FLAG是否可用mouse monoclonal的FLAG一抗，他都叫我用rabbit polyclonal的FLAG一抗 雖然我覺得做不出來大概還是我技術的原因居多...... ------------------------- 附上buffer成分 10x running buffer:30.3 g Tris base, 144 g Glycine, 10 g SDS,用二次水配成1L 1x running buffer就是將10x的用二次水10倍稀釋 10x transfer buffer:30.3 g Tris base, 144 g Glycine,用二次水配成1L 1x transfer buffer就是取50 ml 10x，加二次水到450 ml後再加50 ml methanol再混勻，平常存4℃ 10x TBST:40 g NaCl, 12.1g Tris base, 5 ml Tween20,用二次水配成500 ml, pH 7.6 1x TBST就是將10x的用二次水10倍稀釋 4x sample buffer:10 ml的 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), 1.6 g SDS, 8 ml 100% Glycerol, 80 mg Bromophenol blue, 1.6 ml β-me 平常存在-20，分裝1 ml，要用時將那1 ml放室溫等它融後再使用 -------------------------- ps.做膠參照類似這張表http://imgur.com/IMtaj8x 做8 % gel跑FLAG，10 %跑Myogenin 如提供資訊不足請再通知 謝謝！ --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 111.248.103.200 ※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1472399550.A.C43.html loading和抗體我每次都下一樣的量喔 順便想請問如果loading減半那transfer條件要改嗎？ 謝謝！ ※ 編輯: MLSHBen (140.112.122.57), 08/29/2016 11:07:15 想請問sigma那支難用的意思？因為我也有用成功過一次...那為什麼Rab會比較好用？ 圖的話我用電腦都看得到，用App我反而是第二張看不到（如果有需要的話我等一下改一下） 謝謝！ ※ 編輯: MLSHBen (140.112.121.239), 08/29/2016 15:05:16 ※ 編輯: MLSHBen (140.112.130.149), 08/29/2016 18:16:44 ※ 編輯: MLSHBen (140.112.122.57), 08/29/2016 18:20:24 圖有重弄一下可以幫我看一下這次看得到嗎？ pull down那個就是IP，不過現在跑的這個lysate一開始跑就像第三張圖那樣 是後來學長和我照我上面寫的流程重跑一次才得到第一張圖的結果 然後之後自己再做一兩次有得到第二張圖和第三張圖的結果 ※ 編輯: MLSHBen (140.112.130.149), 08/29/2016 18:45:25 ※ 編輯: MLSHBen (140.112.130.149), 08/29/2016 18:48:45 前面tynse71864大提到只能定電壓或電流其中一個，另一個是最高上限 那照我的流程就是一開始電流定在200 mA，當電壓到最高上限10 V時就變成定電壓的意思嗎？ 所以問題可能會是在這邊嗎？ 謝謝！ ※ 編輯: MLSHBen (140.112.130.149), 08/29/2016 20:24:17 ※ 編輯: MLSHBen (140.112.130.149), 08/29/2016 20:25:04 ※ 編輯: MLSHBen (140.112.130.149), 08/29/2016 20:28:51 請問怎麼看marker來知道有沒有出事？是指marker的band變有一點點圓和厚嗎？ 如果是這樣那該怎麼解決呢？ 謝謝！ 話說最近壓片明明沒壓多久(大概不到1分鐘吧)也會把marker給壓出來 所以也有想說會不會是blocking的問題導致第三張圖那樣？ ※ 編輯: MLSHBen (140.112.130.149), 08/29/2016 20:54:55 sample是上個月月初收的，保存在-80 反覆解凍大概五次左右 聽說實驗室學長的sample好像反覆解凍好幾次都還可以跑的樣子 難道跟RIPA buffer裡加的protease inhibitor有關？ 先謝謝大家這麼熱情地幫我解惑！ 由衷感謝！ ※ 編輯: MLSHBen (36.229.234.9), 08/30/2016 02:53:33