作者kaofei (phoebe)
看板Biotech
標題[求救] plasmid用insert primer P出vector??
時間Wed Aug 17 21:15:25 2016
前情提要：
我用的vector是thermo的pJET1.2，大小2974 bp
insert大小約4.2 kb，是用HiFI系列polymerase出來的blunt end產物，切膠純化
按protocol ligate後使用自製的competent轉型，amp篩
隔天長出約100個colonies
挑8個colonies抽mini，做RE digestion
沒切出預期的片段，只有Vector，沒有insert，或insert大小不對
但因為不信邪...
拿抽好的plasmid，用insert的primers跑PCR跑膠
結果八個都有跑出Band！！但都是vector的大小 (3000左右)！！
不太明白為什麼會這樣...
是汙染的意思嗎？
抱歉是Cloning新手，有爬文也和其他人討論過
之後會用別梯的PCR產物repeat實驗
但在這之前很想知道這次的結果代表哪個環節出了問題
謝謝！！
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※ 編輯: kaofei (118.165.158.16), 08/17/2016 21:16:36
1F：→ blence: 你會不會覺得那個3000,剛好是你加入的vector template？ 08/17 21:21
2F：→ kaofei: 我是這麼覺得的，但我不太懂為什麼會這樣... 08/17 21:41
3F：→ kaofei: 因為我是用insert的primer去P的@@，怎麼會P出vector 08/17 21:42
4F：→ kaofei: 還是說我其實也沒P出東西，是我vector濃到直接跑膠就有ban 08/17 21:43
5F：推 Bows: 其實這大小不用太多就會有band 了，用一管沒有p的跑看看 08/17 22:12
6F：→ Ianthegood: ligation有很多蟲可以抓 交代一下vector/insert如何 08/18 01:31
7F：→ Ianthegood: 處理 濃度 ligation condition唄 08/18 01:32
8F：→ kaofei: ligation是按protocol，22度C一小時，V:I=1:5 08/18 19:16
9F：→ kaofei: 然後我今天用沒P的plasmid跑膠，果然出現3000bp的band... 08/18 19:18
10F：→ blence: 算一下照protocol是不可能V:I有1:5的,肯定有算錯或誤解 08/18 19:29
11F：→ blence: 而且這套我用起來幾乎不會有vector only,肯定pJET是過多 08/18 19:31
12F：→ kaofei: 這次ligation是一個很熟pJET的朋友帶我做的，protocol上 08/18 19:36
13F：→ kaofei: 寫可以按比例調整ratio，不太懂為什麼不可能1:5？因為我朋 08/18 22:02
14F：→ kaofei: 友都是用1:5去ligate的@@"，當天加的量也請他確認過。 08/18 22:04
15F：→ Ianthegood: vector有cip過嗎? primer 5'有phosphate嗎? 08/18 22:14
16F：→ Ianthegood: 1:5 量勒? 08/18 22:15
17F：→ blence: pJET1.2用blunt-end cloning kit,不需cip或加P啦 08/18 22:19
18F：→ blence: protocol算一下,20ul reaction中取50ng pJET,依照1:5計算 08/18 22:19
19F：→ blence: 你的4.2k需要350g,佔全部20ul中的8ul,固濃度至少43.8ng/ul 08/18 22:19
20F：→ blence: 如果是切膠純化用20ul水來elute,代表PCR產物幾近0.9ug 08/18 22:20
21F：→ blence: 如果先不管切膠純化效率了,如果PCR若不混合5~10管如何辦到 08/18 22:20
22F：→ blence: 又如果這kit需要混合多管,顯示PCR效率不佳,也無法達如此量 08/18 22:23
23F：→ blence: 最可能的解釋是用錯1:5的意義,造成vector加太多,導致最後 08/18 22:25
24F：→ blence: colony長出一大堆不該長的false postive 08/18 22:27
25F：推 ABULA666: 我之前用過這個kit，建議:(1)vector only太多請用kit附 08/19 01:58
26F：→ ABULA666: 的水(2)insert和vector的比例可多試幾種(3)ligation時間 08/19 01:59
27F：→ ABULA666: 可以再長(如o/n)，反應溫度可用14或4度嘗試(4)確認你的 08/19 02:00
28F：→ ABULA666: 片段可在你用的competent cell和temp.及抗生素濃度下 08/19 02:01
29F：→ ABULA666: cloning到 08/19 02:01
30F：→ ABULA666: 與其在這裡看半天考慮用哪個的建議不如多試幾種cloning 08/19 02:03
31F：→ kaofei: 謝謝大家的建議，但我不太懂B大的問題，如果我PCR產物有經 08/19 11:52
32F：→ kaofei: 過DCC，濃度不就能提高嗎？我測picodrop濃度是77ng/ul，故 08/19 11:53
33F：→ kaofei: 當時加的量約5，這樣應該有到350ng不是嗎@@還是我誤會了.. 08/19 11:55
34F：→ kaofei: 然後想在請問B大說的false positive是指空的vector污染在 08/19 11:57
35F：→ kaofei: plate上還是只competent cell吞進空的Vector長出來，我以 08/19 11:59
36F：→ kaofei: 吞空Vector不會長的...因為自接會induce lethal gene 08/19 12:00
37F：→ kaofei: 還是這個機制並不可靠?? 08/19 12:01
38F：推 ABULA666: 我認為會導致false positive跟水乾不乾淨有關，kit附的 08/19 14:14
39F：→ ABULA666: 水通常比較乾淨，如果是不乾淨的水容易混nucleotides， 08/19 14:15
40F：→ ABULA666: 有機率卡在vector blunt-end，所以跑膠時就會看到跟 08/19 14:17
41F：→ ABULA666: vector類似大小的片段 08/19 14:17
42F：推 ABULA666: b大說的是指加太多DNA到competent cell裡，DNA的體積應 08/19 14:20
43F：→ ABULA666: 小於competent cell的10%，太多會影響轉形效率 08/19 14:21
44F：推 ABULA666: 至於這機制是否可靠，就我經驗若水夠乾淨挑到vector 08/19 14:24
45F：→ ABULA666: only的機率不會太高 (約占10~20%)，如果是用從自來水做 08/19 14:26
46F：→ ABULA666: 的sterile ddH2O機率會變很高 08/19 14:26
47F：→ blence: 抱歉,樓上誤解我的說,我認為是加太多pJET,但insert不夠多 08/19 14:28
48F：→ blence: 導致太多pJET跟雜質(nt)接在一起,甚至兩兩自黏 08/19 14:28
49F：→ blence: 如果要講濃度就用Qubit測,不然就用切膠前的band去評估量 08/19 14:28
50F：→ blence: 因為一般狀況我不相信這樣的PCR會做出>500ng的純的產物 08/19 14:29
51F：→ blence: 至於水,我們都是ddH2O滅菌後開來用的,通常用的V減少,我都 08/19 14:31
52F：→ blence: 直接送seq不跑膠的,用這kit只需要檢查seq有沒有突變就好 08/19 14:32
53F：→ Ice9: 抽好的 Plasmid，為什麼要 PCR 再跑膠？直接跑膠確認size不 08/20 23:36
54F：→ Ice9: 不更快更省。頂多花半小時到一小時加RE切一切。 08/20 23:37
55F：→ kaofei: I大說的對，是我沒想通見笑了XD" 08/21 17:29