作者a14743535 (pig)
看板Biotech
標題[求救] transfection 細胞變少
時間Fri Aug 12 15:19:14 2016
大家好
我最近在用Panc1這株細胞做轉染的實驗
轉染試劑是用lipofectamine 2000 (2uL/well)(24well的條件)
DNA總量為3.5ug/well
細胞取80000顆種入24孔盤
在20-24小時的時候開始轉染
在加入了Lipofectamine/plasmid complex 培養4-6小時之後
更換成新鮮培養基
這個時候我在吸除含轉染試劑的培養基時候
就發現 常常會有細胞被我吸起來而變少的情況
有時會有很明顯的一大片消失(之前其它細胞HepG2, CHO-K1也是)
我記得lipo本身就是有毒性的
所以細胞或多或少變脆弱被吸走也是正常
問了我的同事們有沒有也會這樣
他們說還好 沒有很明顯
於是我想知道到底我這情況是不是正常
或是能做什麼改善？
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1F：→ blence: 我覺得lipo2000在24well用2ul是非常多(毒)的,有調整空間 08/12 15:37
我是照著它在24well的最低建議量來試的
不知道blence大 建議可以下修到多少？
2F：→ darkdoor: 現在毒性小很多的試劑價錢也不差.不用一定堅持lipo2000 08/12 16:31
3F：→ saviora: 用3000這些升級版的 應該可以減少毒性 08/12 18:07
沒辦法~實驗室還剩很多lipo2000
※ 編輯: a14743535 (36.226.246.166), 08/12/2016 22:09:47
4F：→ lail: 細胞太滿嗎？所以整片被吸起來了 08/12 22:27
5F：推 tynse71864: 咦新版跟舊版差好多… 我24well才下0.8ug DNA+2ul lip 08/12 22:36
2uL lipo2000 大大不是跟我用的一樣嗎？
但我DNA總量為3.5ug/well
6F：→ tynse71864: o ; 但通常我 lipo會砍半或再砍半(即2.5)用 08/12 22:36
是0.5手誤成2.5嗎？
7F：→ tynse71864: 前一天細胞養在哪裡啊 08/12 22:36
就直接種在24well裡，培養20~24小時；開始進行轉染
※ 編輯: a14743535 (36.226.246.166), 08/12/2016 23:10:44
8F：推 gustpigex: 實驗室剩很多沒辦法買3000的話 2000的可以促銷給我們> 08/13 00:34
9F：→ gustpigex: < 08/13 00:34
10F：→ blence: 在24well要用到3.5ug,那lipo用2ul也不夠阿 08/13 00:36
11F：→ blence: 要先降低DNA用量,如果已知是plasmid或RNAi效率問題 08/13 00:38
12F：→ blence: 應該跟本去換backbone,而不是忍受超多的DNA用量 08/13 00:40
13F：→ lail: 我之前6-well一個well送4 ug DNA,LF2000 加10ul 08/13 10:06
14F：推 tynse71864: 是0.5ul sorry; 新版的 DNA建議量都有點太高,找一下舊 08/13 12:21
15F：→ tynse71864: 版的 08/13 12:21
16F：→ genep: DNA 太多, lipo用2, DNA用1差不多. 08/14 00:24
前幾天老師要我把plasmid都直接拿去跑電泳~
確認一下是不是都還是處於非linear的樣子
如果不是linear 那是不是single band
到這裡我就有個問題
plasmid 不是有circular form及supercoiled form
難道這兩者不會同時出現嗎？
然後我看我的電泳圖
看起來plasmid都有一些變成linear form但量不多
這是我抽plasmid的技術不好嗎？
※ 編輯: a14743535 (203.71.94.31), 08/15/2016 13:34:50
17F：推 ABULA666: 如果你的plasmid是直接抽完作transfection，當然理論上 08/19 02:09
18F：→ ABULA666: plasmid是circular，又會因機率出現supercoiled form 08/19 02:10
19F：→ ABULA666: 所以你在膠上當然不會看到linear，除非你有用限制酶切 08/19 02:12
20F：→ ABULA666: 另外想看linear和circular最好用TAE bfr.，不知是否用這 08/19 02:13
21F：→ ABULA666: 回歸回來，如果所有的試劑,培養液和細胞都跟別人一樣 08/19 02:14
22F：→ ABULA666: 但實驗做出來你的就是有問題，那就請人看你操作是否沒問 08/19 02:15
23F：→ ABULA666: 題，反之如果材料不一樣，可能有汙染之虞，請更換再試 08/19 02:15
24F：→ huosheng: 消失整片的狀況，我有遇過，只是主要在換optiDMEM過程 10/16 09:36
25F：→ huosheng: 中觀察到，實際原因還不太明確，可以嘗試medium沿壁面緩 10/16 09:36
26F：→ huosheng: 慢加入 10/16 09:36