作者polomi (POLOMI)
看板Biotech
標題[求救] 有關質體定序
時間Fri Jun 24 21:11:59 2016
發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出
以方便板友幫您追蹤問題
若是求救事項涉及實驗室智慧財產(例如細胞細菌植株、質體載體等）之分讓，
請務必註明貴實驗室願意設立 正式合作或 簽署材料分讓協議(MTA)，否則版工將逕行刪除
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有關質體的定序問題
我是用pUC18作為載體，
送入一段約1.1K的序列。
以BamHI/EcoRI作為切位，
過程中都有跑膠切膠純化。
定序之後結果都有很多不同的點突變產生，
後來也將原本的pUC18送去定序，
利用其質體上M13F-40與M13R-48去定序。
兩者中間為MCS片段，
與原本的pUC18序列比對，
發現在465位置上少了一個G，
1062位置的A變成了T。
http://imgur.com/C9iLMBN
這是否代表了我的pUC18是確定有問題的。
也造成了質體是否會影響細菌不正常生長的可能性?
而我也有做藍白篩篩選，
在DH5a下送入pUC18 的確會產生藍斑的。
請求各位幫助了。
邁入碩班的第三年了...
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1F：→ xxtomnyxx: 定訊螢光訊號的圖呢？然後要去找到這個突變點在哪裡不 06/24 21:24
2F：→ xxtomnyxx: 是很簡單？那就看看有沒有突變在重要的 feature 上啊！ 06/24 21:25
3F：→ xxtomnyxx: 喔好，我幫你查完了，突變點在 ori 上，這是很重要的序 06/24 21:28
4F：→ xxtomnyxx: 列，但是在我手上的資料那個序列本來就是 T 06/24 21:29
5F：→ xxtomnyxx: 我實在很想說而且也說出來了，碩班念完兩年這不是基本 06/24 21:29
6F：→ xxtomnyxx: 功中的基本嗎？還是說你不是分生領域的碩班？ 06/24 21:30
7F：→ polomi: 對不起，我是化學所的碩班.....我會再多加努力的 06/24 22:19
8F：→ polomi: 現在吃飯中，今天或明天會放上來定序的訊號圖，可以的話， 06/24 22:22
9F：→ xxtomnyxx: 你的 pUC18 的序列是實驗室的前輩給的嗎？有可能是前輩 06/24 22:28
10F：→ xxtomnyxx: 給的序列有錯喔。建議你上網搜尋 pUC18 的 序列來比對 06/24 22:28
11F：→ xxtomnyxx: 看看。 06/24 22:28
12F：→ xxtomnyxx: 另外，你如果是用一般的 Taq polymerase 把 DNA 放大再 06/24 22:29
13F：→ xxtomnyxx: 切酵素跑膠純化然後接到 pUC18 的話，1.1K 是有可能有 06/24 22:30
14F：→ xxtomnyxx: 突變，通常要做 cloning 的時候用的 polymerase 會是比 06/24 22:31
15F：→ xxtomnyxx: 較高級的 High-fidelity polymerase 06/24 22:31
16F：→ e104582001: 有時候定序不要只是看序列，有問題的地方要看該位置訊 06/24 22:34
17F：→ e104582001: 號的 pick 的單一度，有時候可能是誤讀 06/24 22:34
18F：→ blence: 猜,不是真的有突變,而是1.1k太長,訊號不佳軟體誤判pick 06/25 00:33
19F：推 Invec: 加油 06/25 00:46
20F：→ blence: 至於那2個點突變,其實把addgene跟NCBI的pUC18來blast就會 06/25 00:48
21F：→ blence: 覺得pUC18的序列應該不只一個版本 06/25 00:49