作者gustpigex (鼻子好像灌太多了)
看板Biotech
標題[求救] DNA Gel extraction的效率很差
時間Thu Jun 9 00:26:55 2016
各位好，最近剛做gel extraction的實驗，但recovery的效率非常的差，想請各位幫幫忙。
我是先用2 microgram的plasmid先用限制酶切，分離後切下來，我所要的DNA大小約13kb。
接下來是使用QIAGEN的kit做gel extraction，步驟都照著protocol做，wash的步驟加buffer後有等一陣子再離心,elute的時候又是加了水之後等一陣子才離心。我是用15 microliter的量做elution。最後用nanodrop測濃度。
做了好幾次濃度都在1.5(ng/ul)，也太低了吧。
目前已排除plasmid切不完全的問題，因為不管切4hr還是切overnight濃度都差不多。
想問的問題是
(1)用kit內的elution buffer效果會不會比水好。
(2)elution buffer的體積會不會有影響。
(3)我們實驗室是用QIAGEN的PB buffer做binding,但protocol是寫QG buffer，雖然兩者都可以拿來做binding，但不知道效果有沒有差。
(4)有沒有其他的小細節要注意的，或是有其他更好的kit
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1F：→ blence: 你有看過manual上那張elution體積與回收率的關係圖? 06/09 00:41
2F：→ gustpigex: 有，但是同實驗室的人用相同體積做，濃度就是比我高十 06/09 01:13
3F：→ gustpigex: 倍… 06/09 01:13
4F：→ xxtomnyxx: Elute 的溶液有沒有先加熱？用水和 TE 效果差不多，主 06/09 01:55
5F：→ xxtomnyxx: 要是差在 DNA 穩定性還有 EDTA 對後續實驗有無影響 06/09 01:55
6F：→ xxtomnyxx: 我想問為什麼 protocol 寫用 QG 你還要用 PB buffer? 06/09 01:56
7F：→ blence: 濃度就算高你10倍，回收率也才11%，也很慘 06/09 02:12
8F：推 as862437: 找人跟你side by side 做一次 06/09 02:37
9F：→ sy2: PB buffer只適用於液狀的PCR product純化，本身沒有溶膠的成 06/09 04:53
10F：→ sy2: 分，請改用QG buffer並注意膠塊大小與QG的比例，放65度C以上 06/09 04:55
11F：→ sy2: 的環境，大約每5分鐘搖晃一下，看一下確保膠塊溶解後再過 06/09 04:59
12F：→ sy2: column 06/09 04:59
13F：→ sy2: 液狀的PCR純化也可以用QG buffer，但因含GITC，自己配QG的話 06/09 05:06
14F：→ sy2: 成本比較高。 06/09 05:06
15F：→ gustpigex: 為什麼改用PB據說是因為更之前的學長姐在他的產品的pro 06/09 07:13
16F：→ gustpigex: tocol上把wash那一步的QG buffer劃掉 寫PB 之後大家都 06/09 07:13
17F：→ gustpigex: 照著做 但那份protocol不見了… 我是新來的 我就上 06/09 07:13
18F：→ gustpigex: 網看才發現是用QG 我自己也覺得很奇怪 但詢問學長姐的 06/09 07:13
19F：→ gustpigex: 回答都是他們都照那份protocol做 06/09 07:13
20F：推 mswei: 我以前用這組覺得elute的體積太少elution 06/09 08:44
21F：→ mswei: 的效果也不好我自己都加到30 microliter 06/09 08:44
22F：→ mswei: 然後你的target size 13kb～這組可以抓到 06/09 08:46
23F：→ mswei: 這麼大的DNA嗎？ 06/09 08:46
24F：→ gustpigex: 建議是最大抓10kb 若超過的話elution buffer要加熱 06/09 09:33
25F：→ Ice9: 以前没有kit時，用的是5-10 microgram切下去，分離後以電泳 06/09 10:28
26F：→ Ice9: 在dialysis bag收集。之後再洗洗、沉澱回收。 06/09 10:29
27F：→ Ice9: 有了kit，儘量不要隨意更動步驟，除非你知道差在哪裡。g大的 06/09 10:32
28F：→ Ice9: 加熱建議最好試一試，13kb是相對大了一些，效率問題大。 06/09 10:34
29F：→ Ice9: 建議再加大elution體積或再elute一遍。最後再蒸散些水份。 06/09 10:42
30F：推 AuroraSky: 我覺得Q牌很邪門，全世界都說讚但我遇到的三間實驗室 06/09 12:19
31F：→ AuroraSky: 都用不順，後來改用Zymo就可以上到70-80ng/ul, 06/09 12:20
32F：→ AuroraSky: 260/280 > 1.9, 260/230 > 1.9 有人有在用Zymo的可以 06/09 12:21
33F：→ AuroraSky: 分享我後來修改的protocol, 小細節注意一下產率就很好 06/09 12:22
35F：→ sy2: 的純化binding buffer，至於你說的wash由QG改成PB是怕 06/09 15:15
36F：→ sy2: guanidine鹽類殘留，膠體的溶膠步驟要用含GITC或NaI的buffer 06/09 15:18
37F：→ sy2: 並且膠體純化binding過cloumn後，在酒精wash前會用QG wash一 06/09 15:21
38F：→ sy2: 次可減少膠體殘留。若沒QG buffer溶膠，可以拿其他廠牌溶膠 06/09 15:22
39F：→ sy2: buffer代替，成分大同小異。 06/09 15:23
40F：→ sy2: 你的產量低，可能一開始膠沒溶完全。溶膠請用QG，wash可改PB 06/09 15:26
41F：→ sy2: wash一次，再用80%酒精或kit的 Wash Buffer(要加酒精) wash。 06/09 15:36
42F：→ sy2: sorry 上頭寫錯，改PB不是減少guanidine鹽類殘留，因為PB成分 06/09 16:10
43F：→ sy2: 是guanidine-HCL，而QG是guanidine thiocyanate，都有Gu鹽。 06/09 16:12
44F：→ gustpigex: 謝謝大家的回應回報最新實驗結果，今天我用了Q牌，gene 06/09 16:43
45F：→ gustpigex: aid(借的）和Q牌抽大sizeDNA的kit，全程照著protocol做 06/09 16:43
46F：→ gustpigex: ，elution的水有事先加熱且用30ul，建議多等的步驟也有 06/09 16:43
47F：→ gustpigex: 做。 06/09 16:43
48F：→ gustpigex: Q牌的濃度為2.5(ng/ul)，G牌為12.5，Q牌抽大kit為6.5 06/09 16:43
49F：→ gustpigex: 雖然量都有提升 但Q牌還是很低，想請問各位會不會是kit 06/09 16:44
50F：→ gustpigex: 壞了……因為他們放有點年紀了。 06/09 16:44
51F：推 lail: 也有可能，曾經一起比，放很久的kit回收率真的比較差 06/09 20:59
52F：推 ad1980: 你的 plasmid 是 empty vector 嗎？是的話也沒有想過用 ph 06/10 02:37
53F：→ ad1980: enol/chloroform 試一下看看，我之前都是用這個做 cloning 06/10 02:37
54F：→ ad1980: (cloning)，效果不錯，recovery 也高。 06/10 02:37
55F：→ ad1980: Cloning (ligation) 06/10 02:38
56F：→ ad1980: 如果要乾淨一點的話就用 pcr purification 清一下，不然 06/10 02:39
57F：→ ad1980: 直接拿去做 ligation 也 ok。 06/10 02:39
58F：→ ad1980: Phenol/chloroform extraction 06/10 02:40
59F：推 ararthur: 我的經驗是Gel ext kit放久蠻容易失敗的 大家經驗呢 06/15 02:20
60F：→ osla30: 我記得column有效期？ 06/15 19:32