作者niwe (雲煙)
看板Biotech
標題[求救] 請教製作stable clone cell line花的時間
時間Sun May 29 22:21:02 2016
各位好，
小弟想請問製作stable cell line的時間，
先前有做transient transfection，(要transfect的質體為pCMV載體)
使用polyjet這種kit(另外也比較過lipofectamine 2000及3000)，
效果都不是很好，
因此想把這載體上的目標蛋白先切，再接到病毒的載體，
再進行site-direct mutagenesis，
然後把這兩種質體藉由病毒感染的方式使細胞能持續表達，
請問這樣的時間大約會花多久？
(我先前沒有做過，但實驗室有位助理有經驗，
他初步估計要2-3個月以上的時間)
備註：上次聽到一位同學，
他把這實驗外包給國外的實驗室，
花了十七萬元(但不保證成功)
不曉得這樣換算成實驗的時間有沒有比較划算？
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 210.60.122.151
※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1464531665.A.D38.html
1F：→ sunorange: 17萬偏貴 ，如果自己做 ，大約也要三個月 05/29 23:31
2F：→ e8795623: 順利三個月~17萬不保證成功也太..... 05/29 23:35
3F：→ blence: 訊息不足,是從cloning到挑出mix clone,還是病毒感染或到 05/29 23:47
4F：→ blence: single clone,而且細胞來源等等,答案差異很大阿 05/29 23:49
pCMV上的載體已經有我要的target protein，
要transfect到口腔癌細胞上，
先前發現使用的口腔癌細胞使用polyjet transfect EGFP約3成，
→ Ice9: 為什麼不先做突變再轉到病毒載體上？
謝謝喔，但我不曉得先mutation再轉到病毒載體，
和轉到病毒載體再做突變的差異？
05/30 01:30
5F：推 joseph103331: 細胞種類 挑選方式 是否有類似GFP的marker都會影響 05/30 19:03
6F：→ joseph103331: 速度啦....把材料都攤開來才比較好抓時間 05/30 19:04
GFP marker的意思是甚麼呢？
我先前曾經把我要的protein接上EGFP-N1，
tranfection之後，再使用G418來篩選，
結果養了二代細胞就不亮了，
不曉得是否帶有EGFP的fusion protein就比較難養？
※ 編輯: niwe (210.60.122.151), 05/30/2016 22:23:34
7F：→ blence: 看到你的幾個回覆覺得有著比stable clone更復雜的問題 05/30 22:55
8F：→ blence: 不介意多少錢的話,全部外包是最好的辦法了 05/30 22:58
9F：→ niwe: 聽到b大這樣說，聽起來非常不樂觀，第一次操作就學個經驗吧 05/31 23:00
10F：推 silverberry: 不知道你想要的是 stable pool 或是 stable single 06/07 11:39
11F：→ silverberry: clone, 這兩個時間會差非常多。 06/07 11:39
12F：→ silverberry: 要做病毒的話，實驗室生物安全櫃是不是能配合上。 06/07 11:41
13F：→ silverberry: 想用 adeno/retro/lenti 哪個系統呢? 06/07 11:42
14F：→ b1l3hlkff: 如果細胞都好的話兩週到三週，HEK293ft產生病毒三天， 08/14 17:18
15F：→ b1l3hlkff: 同時感染細胞，看你細胞能長多快，三代後就能拿到。我 08/14 17:18
16F：→ b1l3hlkff: 自己是做乳癌的Hs578t大概兩週就拿到了，但長得慢的可 08/14 17:18
17F：→ b1l3hlkff: 能要一個月。不過建議你把篩選的抗生素換成puromycin， 08/14 17:18
18F：→ b1l3hlkff: G418很難篩。 08/14 17:18