作者kuyar (Alice)
看板Biotech
標題[求救] WB 背景超黑
時間Tue May 17 21:57:47 2016
原po是WB 新手，最近壓一個蛋白，在相同條件下:
40 ug 蛋白量跑膠 ; transfer 320mA 2hr ;用5%脫脂牛奶 blocking 1hr ; 用TBST 洗5m
in 一次後加一抗; 一抗1000倍(用5%BSA稀釋)4度overnight ;用TBST洗3次5min ; 加二抗
10000倍); 用TBST洗3次5min後壓片。
但有時後背景乾淨，有時後背景超黑(整片黑那種),請問會是什麼問題呢? 目前只有sampl
e不一樣，其他條件大致一樣 , 會是跑膠或是transfer的問題嗎? 我壓其他的蛋白ex: ac
tin 背景都很乾淨，卡了好久，希望大家幫幫我 QQ
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 36.230.162.35
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1F：→ osla30: 上完抗體後，wash時間跟次數？
都是5min,3次 05/17 22:36
2F：→ roc0860: blocking的時間呢？
都是一個小時 05/17 22:55
3F：→ moon0126: 配一抗有沒有加牛奶或BSA?
一抗是用5%BSA 05/17 23:01
※ 編輯: kuyar (36.230.162.35), 05/17/2016 23:10:10
4F：→ blence: 發文說明明明有寫"請將實驗的步驟、所用的條件大致列出"阿
補充了!!05/17 23:13
※ 編輯: kuyar (36.230.162.35), 05/17/2016 23:23:37
※ 編輯: kuyar (36.230.162.35), 05/17/2016 23:24:12
5F：推 bluecsky: 有沒有多load一個必定成功的來做對照組? 05/18 06:10
6F：→ bluecsky: 因為如果blocking沒問題 antibody也是一樣的 那有時黑 05/18 06:11
7F：→ bluecsky: 有時乾淨有沒有可能是因為你的sample的訊號強度不夠 05/18 06:11
8F：→ bluecsky: 造成相對的髒?不過你壓片時間都一樣這樣也怪怪的 05/18 06:13
9F：→ bluecsky: 如果可以 把成功的圖跟失敗的圖貼上來或許更容易有解答 05/18 06:14
10F：→ a09356684: 二抗我是用20000X稀釋 加在TBST含5%牛奶中一小時 05/18 08:17
11F：→ a09356684: TBST wash都10min 二抗濃度太高而sample訊號又弱的話 05/18 08:18
12F：→ a09356684: 二抗很容易亂接 但訊號強的在二抗時我就不會再加牛奶了 05/18 08:21
13F：推 ebv: 試試:1.洗更多次點或延長時間 2.降低二抗至2萬倍甚至更低 05/18 17:34
14F：→ ebv: 另外1抗有時也會有影響 poly會比mono髒 但你是背景全出來了 05/18 17:35
15F：→ ebv: 也有可能抗體會亂黏(雜質或濃度高)參考data sheet的建議看看 05/18 17:41
16F：→ e8795623: 40 ug好像有點太高了耶 我都用2ug/well就很夠了 05/18 18:15
17F：→ satan317: 樓上要看抗體強度 05/18 21:45
18F：推 aaaazzzz: total protein 20-50ug應該都可接受 05/18 22:06
19F：→ aaaazzzz: 二抗有時我用1:4000,背景也還好(不過要看牌子,有些真的 05/18 22:09
20F：→ aaaazzzz: 很髒),我認同sample表現量低(所以拉高曝光時間造成背景 05/18 22:10
21F：→ aaaazzzz: 髒),或者wash不夠(轉速不夠或時間不夠久) 05/18 22:10
22F：推 tynse71864: 你一抗用多少體積阿? 是用雜合袋嗎? 05/18 22:34
23F：→ keystones: 據個人經驗,可能一抗濃度太高,可以考慮再多稀釋一點 05/20 10:33
24F：→ keystones: blocking milk可以過濾,避免雜質卡在membrane 05/20 10:35
25F：→ keystones: 另外抗體是poly clone或mono clone,壓出來品質會差很多 05/20 10:36
26F：推 joseph103331: 我的經驗上,背景黑色帶點狀的一般是一抗過高 05/22 12:28
27F：→ joseph103331: 黑色雲霧狀的是二抗過高, 多loading會造成整條很強 05/22 12:28
28F：→ joseph103331: 但不至於背景太髒 05/22 12:28
29F：→ joseph103331: Wash可以拉長,抗體可以在4度作用都能減少背景值 05/22 12:29
30F：→ joseph103331: 但目前的狀況很像是二抗每次配不一樣造成的,盡量用 05/22 12:30
31F：→ joseph103331: pipet的方式精準配出二抗才有助於抓濃度 05/22 12:30
32F：→ a910298: 同一種二抗,看要不要一起在同一杯beaker 2%牛奶配,再利 05/31 10:10
33F：→ a910298: 用攪拌子攪拌,二抗會分布較均勻,而不會只集中在一個地方. 05/31 10:10
34F：推 ararthur: 因為沒有看到圖 幾個簡單的建議你可以試試 全程用5%BSA 06/15 02:26
35F：→ ararthur: 或Milk 我試過BSA可以 Milk出大問題的 第二個換一家二抗 06/15 02:27
36F：→ ararthur: 或用原本二抗+同sample memb剪幾條 2倍2倍titrate看看 06/15 02:28
37F：→ ararthur: 3 換包底片...在想該不會是底片不小心被曝光過了吧 06/15 02:29