作者tynse71864 (TATA box)
看板Biotech
標題[求救] HMW protein detection
時間Sun May 8 23:11:57 2016
版大們晚安
小弟最近在處理一個~250kDa的protein
但western一直都壓不太出來....(以下會詳述)
有逛了一些討論版 但還是做不太出來/很醜
因此想上來請問一下大家的看法
1. 由於我的protein是lipo外送的
理論上量會很多 (以前paper也很多人做過)
我是想問 如果我今天送一樣量 (ex:10ug的DNA)
一個是表現10kDa的蛋白 一個表現250kDa
兩個表現量會有差別嗎? (還是一定要考慮protein的modification)
2.Cell lysis
目前是用0.2% NP40 lysis bfr做 學長之前做出來的條件
rocker 轉+ vortex 15min (會太短嗎? )
也因為此protein會secrete, condition medium會外加至0.2% NP40 & 1mM PMSF
去掉cell debris後放冰上
之後Lysate 跟medium 做IP o/n, wash三次後加2x smp bfr 煮
(有試過不IP直接跑 看不到一點痕跡
別的實驗室做此protein, 即便是外送 都還是會IP 所以照做)
3.SDS-PAGE
我之前是跑4%的gel 但我上膠是5%....
這會影響嗎? (跑出來是歪歪扭扭的沒錯 但想確認； pH上6.8下8.8)
跑膠條件: 90V 約2hr ( Biorad tetra cell system)
Running bfr 是tris-Glycine SDS (就一般用的)
Marker是Thermo 的Spectra MR (Max 300kDa)
PS 此情況下 marker位置準嗎?
4.Transfer
條件是根據討論版的結論測的 125mA 120mins
Transfer bfr: Tris-Glycine / 10% MeOH / 0.05% Tw20
(建議SDS或tw20或不加的都有,我就用較weak的)
transfer完後 marker都有過去
後續處理就是一般的western方法 之前做到130kDa的protein都沒問題
(抗體的部分 因為我學長壓的出來 所以應該不是這問題
但跟一般100kDa以下的壓出來算是不太好看 )
就這個250的一直壓不出來...
希望大家能給一些意見~~
謝謝
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 36.228.136.116
※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1462720320.A.33E.html
1F：→ blence: 如果,一個protein沒有特殊理由都得先IP才能用WB偵測,那表 05/08 23:19
2F：→ blence: 示抗體有根本的問題:請先了解抗原-抗體特色,與IP的目的 05/08 23:22
因為不只我們實驗室啦@@...10幾年前的paper~最近 用Hela/COS-7做外送 還是會先用IP enrich (或是TCA 沉澱)
而且抗體跟我們家現在用的不同隻
我也想過這東西真的有少到一定要IP嗎 所以才有 1. 的問題
但我要認真想一下我家抗體是不是壞掉...囧
3F：→ blence: 我做3,400kd才用6-7.5%PAGE,250kd而已的大小不太是問題 05/08 23:26
目前也正改用6% gel
想請問一下B大的跑膠及transfer條件是?
4F：→ blence: 你內容說學長做的出來,那應該先問他?(還是又畢業離開了?) 05/08 23:39
還在XD 但他習慣跑大片膠 我不太會處理大片的 所以跑小的
因此跑膠condition有些差異
剩下基本上是完全發樓
5F：推 joseph103331: 1當然會有差, plasmid的量決定在鹼基多寡, 兩者 05/09 01:15
6F：→ joseph103331: 大小差這麼多, plasmid個數根本不能相比 05/09 01:15
7F：→ joseph103331: 有點口誤, DNA的量決定在鹼基多寡, plasmid的量就需 05/09 01:17
8F：→ joseph103331: 要考慮到質體的大小, 同樣10ug, 10kDa的絕對比 05/09 01:17
9F：→ joseph103331: 250kDa的表現質體多非常多個,表現量就會少很多倍了 05/09 01:18
J大說的就是我一開始想的點...
10F：→ blence: 用plasmid多寡來解釋表現量看似合理,但如果不是以定量RNA05/09 12:13
11F：→ blence: 而是WB,不同的抗體是無法證明表現量差異05/09 12:14
12F：→ blence: 而且實際算一下plasmid,100bp跟5.5bp,看似差55倍,但如果接05/09 12:18
13F：→ blence: 到pcDNA3上,一個copy變成5.6k與11k的差異,只差兩倍而已05/09 12:19
14F：→ blence: 或許不同長度的轉錄效率,比plasmid的copy差異還大很多05/09 12:21
謝謝b大 你順便幫我解決了一個快兩年的問題....
那假若我今天在兩個protein後都接Flag 並用flag 做western 應該可以解決抗體的問題?
15F：→ Ice9: WB不容易測到，除了抗體問題，還有可能從一開始就有問題啊。05/09 15:44
16F：→ Ice9: Plasmid Seq 壞了，Transfection 效率差(你的對照組如何？)05/09 15:46
17F：→ Ice9: 跑膠時的量——大片膠不難搞，你應該學著如何建。05/09 15:47
18F：→ Ice9: 既然以前很多人做過，那蛋白修飾問題應該不是影響你結果的主05/09 15:49
19F：→ Ice9: 要因素。另外，目標細胞的狀態也有可能會影響結果。05/09 15:50
20F：→ tynse71864: 先謝謝各位 這幾天想了一下後再來板上回應05/11 12:48
plasmid跟seq都是對的喔 Hela transfect大概6~7成,細胞狀態應該OK
其實大膠我會 就只是單純覺得如果小膠可以 為何不能跑小的就好 (因為就看一條band)
※ 編輯: tynse71864 (36.225.70.25), 05/13/2016 12:23:00
21F：→ blence: 想這樣比較表現量還是從RNA著手;同一construct把tag接N或C05/13 19:17
22F：→ blence: 抗體偵測都可能不同了,何況不同蛋白變因更大05/13 19:21
23F：→ blence: 如果是同construct的delete或mutation,應該就方便這樣比較05/13 19:25
因為我的 wt跟 mutant protein， 每次外送 結果表現量都不一樣多 (但 wt一定比較多,只是看多幾倍)； 但試過接 flag後外送, IB Flag 表現量就會一樣。 抗體是bacteria recombinant wt protein打兔子來的
※ 編輯: tynse71864 (42.73.20.24), 05/13/2016 20:29:34
24F：→ tynse71864: 我會在 check 看看,非常感謝 05/13 20:31
※ 編輯: tynse71864 (1.171.39.66), 05/15/2016 11:18:41
25F：→ Ice9: 大片跑下來，大MW可以比較漂亮的。你確定只會有一條band? 05/15 22:39
26F：→ Ice9: wt和mt表現量差到兩倍以上，不是就足以讓你們探討其中的問題 05/15 22:43
27F：→ Ice9: 了嗎？會不會是穩定性變低了，或對細胞很不友善？XDD 05/15 22:46
28F：→ blence: 好像越看不懂了,前面講HMW壓不到,後面又可以看到wt,mt差異 05/15 23:16
29F：→ blence: 會不會你只是mt表現的問題,就無關跑膠至WB的過程了阿 05/15 23:18