作者ccclaz (ccclaz)
看板Biotech
標題[求救] PCR一直smear
時間Fri Apr 29 09:50:08 2016
<補充>
先前長官給我一個10K plasmid跟一對完全互補的primer
要我做mutagenesis 直接P出一個完整的plasmid
先列PCR的條件
10K plasmid 2 ul
10uM primer 1 ul
Phusion pol. 0.5 ul
2.5mM dNTP 4 ul
5x buffer 10 ul
10% DMSO 15 ul
ddH2O 17.5 ul
----------------------
Total 50 ul
因為primer彼此完全互補(迫於無奈不能改QQ)
一般PCR只會產生primer dimer
我使用two-stage PCR來跑
98C 30sec
98C 10sec┐
50C 30sec│5 cycles
72C 3min ┘
Mix
98C 10sec┐
50C 30sec│30 cycles
72C 3min ┘
72C 10min
但目前只能跑出一堆smear
http://i.imgur.com/NNVjpwZ.png
上圖lane2~lane8為跑gradient 60C~50C的結果
現在我試過的條件如下
1.primer預測Tm為50 跑gradient50~60皆smear
2.Plasmid約10K 測試過20ng和2ng皆smear
3.primer測試過0.2uM 0.02uM皆smear
4.Taq測試過減半用量皆smear
5.cycle數降低為3+25皆smear
想請問還有什麼方法可以嘗試
感謝大家
--
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1F：→ Ice9: 真不能換 primer? primer長度多長？可有再延長設計的可能？ 04/29 09:55
27個mer 我只是個菜鳥助理 現階段的處境就只能先試條件
2F：→ Ice9: 然後，10K 產物用 Taq? 有一定程度的 mutation 耶。 04/29 09:56
Pusion polymerase其實不算Taq 我只是怕有人沒聽過 那我改一下好了
3F：推 pwl: 不曉得你有沒有試過DMSO？ 04/29 11:29
有喔
4F：→ pwl: 抱歉，漏看條件了，原來已經加了 04/29 11:30
5F：推 huuban: 如果是Phusion做10k應該沒有問題，我認識的Phusion不是Taq 04/29 12:13
你是對的
6F：→ huuban: template做別的PCR能做出東西嗎？搞不好根本壞了 04/29 12:14
沒試過P其他東西 那但我有自己重新轉殖抽plasmid 新舊結果一樣
7F：→ huuban: primer TM可否再拉高？ 04/29 12:15
嗯 我試試
8F：→ blence: 完全互補又不能改的primer好像早期stratagene的Quikchange 04/29 16:47
9F：→ Ianthegood: phusion改版過喔 primer試0.5uM看看 然後我會把single 04/29 20:19
10F：→ Ianthegood: side再拉到10 cycles 04/29 20:19
所以你覺得要提高primer量?
另外first stage增加cycle數不會像用PCR product當template一樣非常容易smear嗎?
雖然我目前的狀況也很像這樣orz
11F：→ xxtomnyxx: 你的 template 10K 然後你要從上面 P 多大的片段？ 04/29 21:30
12F：→ xxtomnyxx: Phusion 我通常超過 3K 的都用 1 kb/40sec 去做。 04/29 21:31
13F：→ xxtomnyxx: 我看你來你這個 smear 技不向 template DNA 也不像做 04/29 21:32
14F：→ xxtomnyxx: 不完整的 amplicon...... 可以給 marker 的大小嗎？ 04/29 21:32
sorry我講的不夠清楚
<補充>
先前長官給我一個10K plasmid跟一對完全互補的primer
要我做mutagenesis 直接P出一個完整的plasmid
我是用1 kb/15sec來做的
另外下面是我用的ladder
http://i.imgur.com/Y7cyrbZ.jpg
※ 編輯: ccclaz (118.167.200.167), 04/29/2016 23:06:12
15F：→ blence: 我覺得你沒說清楚是site-direct,是很大的誤導, 04/29 23:19
16F：→ blence: 出問題的點已不只是pcr條件,連要mutation的設計也要存疑 04/29 23:22
17F：→ blence: phusion有出mutagenesis的kit,可以照它protocol修改一下 04/29 23:23
18F：→ blence: 追根探討,上面的人得讓你多了解細節,才能更快解決問題 04/29 23:26
19F：→ blence: 補充下,phusion已不用完全配對了,所以才說上面的人要費心 04/29 23:29
20F：推 jeol1620: 試試看 68℃ 1kb/30sec 或是反應液陪完再多加0.5ul taq 04/29 23:39
21F：→ xxtomnyxx: 我確定一下，你的 primer Tm 是照 Phusion 的算法算的? 04/30 01:54
22F：→ xxtomnyxx: Phusion 的 Tm 跟普通 primer 在用的不一樣，然後請改 04/30 01:55
23F：→ xxtomnyxx: 用 1 kb/40 sec 試試看。 04/30 01:56
24F：→ xxtomnyxx: 另外，用完全互補的 primer 做 SD mutagenesis 是否搞 04/30 01:59
25F：→ xxtomnyxx: 錯了什麼？怎麼跟我印象中的做法不一樣？ 04/30 02:00
26F：→ soom: 推薦這篇 #1EmunDcy 改方法再定一個primer但是簡單很多 04/30 02:52
27F：→ Ice9: 現在做 mutation 不需要用到 two-step 了啊。而 primers 互 04/30 13:32
28F：→ Ice9: 補是常用方法。另外，你的 mutation 往各自的 3' 端會不會 04/30 13:34
29F：→ Ice9: 有非常高的G/C比例，也要考慮一下它們的作用。然後，跑膠時 04/30 13:35
30F：→ Ice9: 最好加個對照組：原plasmid和切過一刀的等等。 04/30 13:36
31F：→ blence: 最早期SD的stratagene protocol就建議用完全互補阿 04/30 21:13
32F：→ blence: x兄可以看一下Quikchange manual 04/30 21:17
33F：→ blence: SD就是要省掉ligation步驟,還加ligase就可惜這設計了 04/30 21:20
34F：→ xxtomnyxx: 喔喔原來如此！但這樣我有個疑問，在PCR結束後加一個緩 04/30 21:47
35F：→ xxtomnyxx: 慢降溫的 hybridization 步驟會不會比較好？ 04/30 21:47
36F：→ xxtomnyxx: 補充，94 C 3 分鐘後再緩慢降溫。 04/30 21:48
37F：→ soom: 也許每個case不同，但個人經驗中Quickchange跟inv-PCR 04/30 23:15
38F：→ soom: Quickchange做了快一個月沒出來, PCR+PNK+Ligase一次就成功 04/30 23:16
39F：→ soom: 不過這是個人經驗，僅供參考 04/30 23:18