作者tijkhj (ㄚJ)
看板Biotech
標題急!! western blotting 一直壓不出來?
時間Wed Mar 30 23:52:30 2016
首po 排板有問題 敬請見諒
小妹我在western上卡關卡很久 想請教有經驗的大大們~~~一點小撇步 來做改善
我用細胞萃取蛋白質去跑的 要壓的東西是IRS-1(和磷酸化的IRS-1) 但一直都壓不出東
西 不知道有沒有有壓成功的大大 可以提供一點意見 我一抗用1:1000 二抗用1:3000
不知IRS-1是不是要萃到細胞膜才壓的出來 還是需要在做什麼來加強 才有辦法~~
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1F：→ sunorange: western 沒出來 ，可能的問題有太多了 03/31 00:01
2F：→ sunorange: 這個蛋白沒有很難壓 ！你先把positive 做出來 03/31 00:02
3F：→ Ianthegood: 什麼細胞 多少細胞 蛋白怎麼抽 loading control 03/31 00:36
4F：→ Ianthegood: 有沒跑sds page 有沒染ponceau positive有沒壓出來 03/31 00:37
5F：→ Ianthegood: 一抗是哪隻 二抗是哪隻 大概的protocol 03/31 00:38
6F：→ Ianthegood: 照你給的資訊就能debug出來大概可以去當算命仙了... 03/31 00:40
7F：→ tijkhj: 我的實驗細胞是c2c12 細胞是用lysis buffer粹 一抗是IR 03/31 01:02
8F：→ tijkhj: S-1 二抗是老鼠 同一片膠actin都有出來就只有IRS-1沒有 03/31 01:02
9F：→ tijkhj: 蛋白濃度度用到60ug 03/31 01:03
10F：→ blence: 如果很急，何不把內容講清楚? 還是不是從頭到尾做過? 03/31 01:15
11F：→ Ianthegood: 問抗體是哪隻的時候往往是在問番號 網路上幾乎都找的 03/31 01:15
12F：→ Ianthegood: 到評價 03/31 01:15
13F：→ Ianthegood: 還有你不會認為全天下的"lysis buffer"配方都一樣吧 03/31 01:16
14F：推 MDM2: 細胞整顆拿去煮 不要離心 03/31 12:28
15F：推 tz2733: 試過1抗hy o/n嗎? 提高一抗濃度? 03/31 14:33
16F：推 michealking: lysis buffer要注意一下你的inhibitor 03/31 14:37
17F：→ michealking: western環節很多 出錯就GG 寫仔細一點吧 03/31 14:38
18F：推 leptoneta: 沒有cat. number連有沒有用錯二抗都不知道好嗎... 03/31 20:43
19F：→ jsi: 是壓endogenous or over-expressed IRS-1? 剛剛看了一些抗體 03/31 21:45
20F：→ jsi: 公司的WB圖，大多都有先刺激細胞或IP後再做WB. 推二樓說的， 03/31 21:49
21F：→ jsi: 先去找確定有表現IRS-1的細胞作為positive control，來證實你 03/31 21:51
22F：→ jsi: 用的抗體是有效的，或者換個人做做看，可能可找到問題所在。 03/31 21:52
23F：→ tijkhj: 一抗cat.#2390和#3203 04/01 02:23
24F：→ tijkhj: 不好意思 想請問什麼是刺激細胞 04/01 02:26
25F：→ tijkhj: 我的做法是細胞分化完 再投藥等藥物作用時間到了之後收細 04/01 02:35
26F：→ tijkhj: 胞 為了可以壓出磷酸化的東西 也有在lysis buffet加入磷 04/01 02:35
27F：→ tijkhj: 酸酶抑制劑 等變性完後 就開始做WB的步驟 其它要跑的東西 04/01 02:35
28F：→ tijkhj: 都有壓出來 就只有這個沒有 以前曾經有壓出過 但就只有那 04/01 02:35
29F：→ tijkhj: 麼一次而已 04/01 02:35
30F：→ blence: 做不出來才是正常的，有band才有問題 04/01 02:39
31F：→ blence: 用CST與Abcam(epitomics系列),尤其新手務必注意Rabbit mAb 04/01 02:40
32F：→ blence: 該用的二抗,多瞭解實驗細節,才不會遇到這類非技術上的失誤 04/01 02:46
34F：→ tijkhj: 二抗用的是Rabbit mAb 前面打錯了抱歉 04/01 16:36
35F：推 ararthur: 是total form也壓不出嗎? 還是只有phospho-IRS-1? 04/03 03:00
36F：→ ararthur: blocking buf 跑磷酸化蛋白建議用BSA泡不要用Milk 04/03 03:01
37F：→ tijkhj: 兩個都壓不出來 blocking buffe 用5%的BSA 用TBS-T配 04/03 12:33
38F：推 tz2733: 抗體有reuse嗎?新配試看看? 04/03 19:54
39F：→ tijkhj: 會重復使用 我重配試試看 可以請問有壓過的前輩 這兩個容 04/03 21:58
40F：→ tijkhj: 易壓嗎？ 04/03 21:58
41F：推 ararthur: 我是做adipocyte tIRS非常容易壓 pIRS則比較難一點點 06/15 12:30