作者sylvialalala (sylvia)
看板Biotech
標題[求救] PCR達人請教 一段怎麼p都p不出來的區域
時間Thu Jan 28 10:44:54 2016
想請教ＰＣＲ達人 有關一段怎麼Ｐ都Ｐ不出來的genome區域(昆蟲)
我之前從沒遇過這樣的問題....已經不知道如何解了
圖示primer設計
A_F B_F B_R A_R
B這段區域約300 bp 是可以成功的
有問題的是A這個區域 約1500 bp
怎麼p都p不出來 （前後已經設計10對primer 交叉互p也都不行）
只有一對有微弱的band 但是不是每個sample都有
試過的條件： TM: primer tm約50~52 每個溫度都有試過 (目前頃向再跑gradient)
mgcl2 2mM （雖然也可以跑gradient 但因為連band都沒有我覺得應該無效）
雖然gc約只有33% 但有試過final 1mM betaine 無效
A_F/B_R 或是B_F/A_R 也失敗 (這裏的A有大概五對primer在試)
請教達人我還可以怎麼試呢？
有增加dna template到2ul 但還是沒改善 (有用positive確認過dna ok)
謝謝！
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 72.89.115.239
※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1453949096.A.DB7.html
1F：推 micocat: 用Taq批看看?! betaine應該是對 GC rich有幫助 01/28 12:36
目前是用invitrogen的amplitaq 也有換過master mix or kapa的taq 還是無法p
→ hitmd: 用哪一支polymerase?
invitrogen的amplitaq 01/28 13:07
2F：→ xxtomnyxx: 1. 加 DMSO 3~10% 01/28 13:38
已試過betaine 或是dmso跟betaine作用不一樣？
3F：→ xxtomnyxx: 2. 增加 denature and/or annealing 的溫度和時間； 01/28 13:38
有試過各種annealing了 但denature的溫度與時間不同會有幫助？
4F：→ xxtomnyxx: 3. 降低 template DNA 的量； 01/28 13:40
有試過1, 2ul 但似乎dna越多p的band越明顯一點
5F：→ xxtomnyxx: 4. 增加 initial denature 的時間 01/28 13:40
6F：→ xxtomnyxx: 5. 換 Phusion polymerase 01/28 13:40
這就要另外買了.....
7F：→ xxtomnyxx: 另外，你確定你手上的昆蟲 genome 序列是完整正確的？ 01/28 13:41
確認是正確的
8F：推 jabari: roche probemaster... 不過是dUTP. 囧b 01/28 15:33
9F：→ Ice9: construct用嗎？為什麼要那麼長？還有不同sample? 另外，GC 01/28 22:06
10F：→ Ice9: content有時並不一定要看目標產物的全長。某一段內有密集出 01/28 22:07
11F：→ Ice9: 現到70-80%以上，甚至是primer附近就有一小段時也要考慮進去 01/28 22:09
12F：→ Ice9: 還有，大的做不了，分成兩三段再接合也是可以想一想的。 01/28 22:11
13F：→ Ice9: 若是做類似鑑種比對，試過degenerate primers嗎？或是像在做 01/28 22:17
14F：→ Ice9: RACE PCR 一樣的方法做設計？ 01/28 22:18
兩三段接合也是無法p (aF/bR bF/aR p不出)
不是鑑種 是要看mutation有無成功
degenerate primer??可以麻煩說詳細一點嗎？
今天try增加到80 cycle (40+40) 還有annealing 跑gradient試試
※ 編輯: sylvialalala (129.85.224.239), 01/29/2016 02:09:07
※ 編輯: sylvialalala (129.85.224.239), 01/29/2016 02:10:14
15F：→ Ice9: 如果不是鑑種，而是針對已知序列中的某一段做確認，那就不需 01/30 20:09
16F：→ Ice9: 要degenerate primer了。 然後，你是哪種 mutation？ 01/30 20:10
17F：→ Ice9: 呃，抱歉，我是想問你做的研究是想分析哪種 mutation? 01/30 20:17
18F：推 micocat: betaine內文提到是加1mM，不知道是不是筆誤，建議加1M 01/30 21:46
19F：→ micocat: 另外genomic DNA denature建議設高一點，98℃或96℃ 01/30 21:48
20F：→ micocat: 不過taq可能稱不太住，調高溫度的話taq可能要加量 01/30 21:49
21F：→ micocat: 另外，要確認有沒有突變怎麼不是用proofreading enzyme? 01/30 21:50
22F：推 ookubo: extension時間? 02/05 04:46
23F：推 jabari: 有時侯就是P不了 建議原po去查看看有沒有其他資料庫ngs的 02/05 16:45
24F：→ jabari: 結果 我前幾年也遇到怎樣也p不到 丟ngs回來coverage超差 02/05 16:45
25F：→ jabari: 然後insel沒人有定論的片段 .... gDNA不行就換從rna下手 02/05 16:45
26F：→ jabari: 吧 囧 02/05 16:45
27F：→ satasumi: PRIMER...多長? 05/13 00:14