作者forever430 (Right of Left)
看板Biotech
標題[求救] 細胞計數
時間Fri Dec 25 16:25:40 2015
大家好
想請問將細胞培養在基材上，想利用trypan blue計算
在基材上活細胞的數量，之間的過程會先用trypsin將
細胞取下然後與medium混合終止反應，接著直接使用
trypan blue進行計數沒有經過離心的步驟，這樣可以嗎?
基材的培養面積為4平方公分，加入的細胞為5萬顆，之前
幾次的實驗有經過離心誤差都滿大，有的組別甚至測不到
細胞數量，所以想說可能是離心完後細胞太少被我倒掉了。
請版友幫忙解惑 感謝
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1F：推 moon0126: 我們實驗室數細胞都不離心的，以打下來的濃度跟體積去計 12/25 18:17
2F：→ moon0126: 算總細胞數 12/25 18:17
3F：→ forever430: 樓上大大一樣使用trypan blue嗎? 12/25 19:20
4F：→ moon0126: 是trypan blue沒錯! 12/25 21:19
5F：→ forever430: OK 那我就不離心分離trypsin，直接計數試看看 感謝 12/25 22:46
6F：→ Echinocyte: 我們也不離，除非細胞濃度不夠，才會2000rpm 2分鐘然 12/26 00:50
7F：→ Echinocyte: 後抽掉一部分上清液再重算 12/26 00:50
8F：推 Echinocyte: 突然發現，推116 XDD 12/26 00:56
9F：推 osla30: 想順帶問問，數完也不離心直接再種回去培養嗎？ 12/26 17:35
10F：→ Echinocyte: trypsin→medium回溶→全吸起來→加要的量(0.5-1ml)到 12/26 21:32
11F：→ Echinocyte: 新盤→剩的放離心管，再取50uL+50uL trypan blue來數 12/26 21:32
12F：→ forever430: 好奇一問：medium終止trypsin反應有多少體積比的根據 12/26 22:48
13F：→ forever430: 嗎？ 12/26 22:48
14F：→ archlich: 1:1也可，重點在你養的細胞對trypsin敏不敏感，normal 12/27 22:02
15F：→ archlich: cell建議利用離心移除trypsin再進行實驗。 12/27 22:02
16F：推 moon0126: 我們實驗室trypsin：medium會到1：3 12/27 22:42
17F：→ moon0126: 如果非癌細胞的話，會加入trypsin覆蓋後吸掉，放incubat 12/27 22:43
18F：→ moon0126: or反應 12/27 22:43
19F：→ blence: 加入trypsin又吸掉是為了什麼? 12/28 08:31
20F：→ blence: 既然這樣何不加少一點 12/28 08:32
21F：→ forever430: 個人感覺：液態太少沒有覆蓋基材，反覆吸沖會產生泡泡 12/28 16:25
22F：→ blence: 反覆吸沖的目的是？ 體積太少是覆蓋不了,但體積多到可以 12/28 16:54
23F：→ blence: 那輕拍搖晃一下就夠了,沒有反覆吸沖的需求阿 12/28 16:55
24F：→ forever430: 我自己習慣沒有在輕拍，都用tip吸沖(看個人手法) 12/28 17:46
25F：→ forever430: 以24的flask養，1mL的trypsin就無法覆蓋，均勻潤一下 12/28 17:52
26F：→ forever430: 放到培養箱30秒~1分鐘，拿出來輕拍或沖吸都可 12/28 17:53
27F：→ blence: 以我來說100mm dish(area 55cm2)約0.7ml, 60mmdish(21cm2) 12/28 18:58
28F：→ blence: 約0.3ml,因此T25(25cm2)對我來說用1ml綽綽有餘了 12/28 18:59
29F：→ blence: 不過就算T25用1ml,我還是無法理解沖吸後再把trypsin吸掉的 12/28 19:01
30F：→ blence: 理由 (還是其實不是吸掉,只是去除泡泡?) 12/28 19:01
31F：→ moon0126: 以0.05%的trypsin來說，10cm dish加0.3-0.4ml, 6cm dish 12/28 19:30
32F：→ moon0126: 加0.2-0.3ml, 放常溫一分鐘可用沖吸將我們家的癌細胞 12/28 19:30
33F：→ moon0126: 打下來，但normal cell line則會在trypsin覆蓋後，將多 12/28 19:31
34F：→ moon0126: 餘的trypsin吸掉，培養箱反應，加如medium沖吸打下，這 12/28 19:31
35F：→ moon0126: 樣的方式對於我們家的正常細胞傷害比較小。 12/28 19:31