補充一些可以考慮的點 ※ 引述《shinchenboy (欣承男孩)》之銘言： : 各位版友大大前輩們好 : 小弟最近實驗想探討在乳癌細胞中某non-coding RNA對於其 : Target protein ubiqutination的影響 : 看paper幾乎都是以IP的方式來做 : 原理大致上是把Target protein用抗體抓下來後 : 然後在western上用Ub的antibody來做hybridization 同前一篇 patricksky 大及其他人所言 你有用過這抗體先測試做 IP 或 WB 嗎? 理想狀態下 你應該要有兩隻對你的目標蛋白質具專一性且能用在 IP 與 WB 的抗體 然後拿一隻來做 IP 另一隻做 WB : 所以小弟我的實驗設計也是仿照paper的模式 : 在MCF-7細胞建立Over-expression ncRNA及Control的Model後 : 隔天在收細胞前先以MG132(20uM)處理4h(也是參考paper的條件) MG132 的使用需小心 首先 MG132加到培養基中會立刻結晶沉澱 要注意搖勻的問題 其次你有沒有做濃度與時間曲線 找出最適合你實驗的處理條件 最後 對某些蛋白質而言 加入 MG132反而會改變其表現 : 然後把細胞收下來後開始進行IP的實驗 : 我的實驗流程如下 : 1.先以RIPA buffer(sigma)冰上反應30min(每5min vortex 10s)，然後離心後取 : 上清液 你有沒有加入 de-ubiquitinylating inhibitors? 例如 NEM, IAA, PR619等 沒加的話 Ub 會在實驗過程中喪失 你預期的 band 會消失 : 2.Protein定完量後，固定為800ug protein為一個IP，總體積200ul，並留80ug protein : 作為Input(先煮好，保存於-80) : 3.先讓Protein和G bead反應約6h，把會和G bead結合的protein分離出來 : 4.把剩下沒和G bead結合的protein加入抗體(1:100)，4度C反應Overnight : 5.隔天把G bead加進去，也是4度C反應Overnight 抗體與 beads 間有沒有做 cross-linking? 特別是你的蛋白質與泛素化後的蛋白質分子量是在一個尷尬的位置 IP 後如果抗體跟著蛋白質一起被洗出 WB 時你就會看到抗體的 band 了 : 6.隔天用磁座把G bead-Ab-protein complex分離出來，用wash buffer洗三次5min 你的 wash buffer 是什麼? 夠不夠 harsh? 這裡需要一個夠 harsh 的 wash buffer 把所有非專一結合的雜質蛋白質全洗出去 只留下你與抗體穩定結合的目標蛋白質 但要這樣做前提是你務必要做 cross-linking : 7.加入sample buffer後煮10min : 8.Western blot : 然後現在結果出來了不太理想，有幾個問題 : 1.看paper Ub-protein沒有只是單一條band而已，譬如我的target protein分子量在43kD ~~~~~~~~~ 這在說什麼? : ，理論上來說它在接上Ub後band會出現在43kD的上方連續好幾條band，但是我的結果似乎 : pattern沒有和paper那麼像，只有兩條band，位置出現在50kD和70kD附近 : 2.我的Negative control抓到很多很奇怪的雜band，而且有兩條也在我預計想看的 : protein相同位置上 同 patricksky 所問, Negative control 是什麼? 你有沒有同時跑兩片 WB? 一片用你手上有專一性, 可辨認目標蛋白質的抗體跑 另一片用可辨認 Ub 的抗體如 FK1, FK2, P4D1 染 再來交叉比對 band 的位置 就可以推論出哪些 band 是有 Ub 的 band : 跟老師和學長姐討論之後，認為那些band都不是我要看的，簡單來說就是有可能我的 : Ab沒有成功把target protein抓下來 : 目前我想到的解決方式有幾個 : 1.先用WB測試我的target protein 有沒有被Ab抓下來 基本一定要做的 : 2.提高IP反應Protein的量 不預期會有效果 : 3.外送Ub plasmid : 想請問各位大大們還有甚麼其他意見嗎??? 感激不盡~ --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 162.129.251.85 ※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1449244433.A.B72.html