各位版友大大前輩們好 小弟最近實驗想探討在乳癌細胞中某non-coding RNA對於其 Target protein ubiqutination的影響 看paper幾乎都是以IP的方式來做 原理大致上是把Target protein用抗體抓下來後 然後在western上用Ub的antibody來做hybridization 所以小弟我的實驗設計也是仿照paper的模式 在MCF-7細胞建立Over-expression ncRNA及Control的Model後 隔天在收細胞前先以MG132(20uM)處理4h(也是參考paper的條件) 然後把細胞收下來後開始進行IP的實驗 我的實驗流程如下 1.先以RIPA buffer(sigma)冰上反應30min(每5min vortex 10s)，然後離心後取 上清液 2.Protein定完量後，固定為800ug protein為一個IP，總體積200ul，並留80ug protein 作為Input(先煮好，保存於-80) 3.先讓Protein和G bead反應約6h，把會和G bead結合的protein分離出來 4.把剩下沒和G bead結合的protein加入抗體(1:100)，4度C反應Overnight 5.隔天把G bead加進去，也是4度C反應Overnight 6.隔天用磁座把G bead-Ab-protein complex分離出來，用wash buffer洗三次5min 7.加入sample buffer後煮10min 8.Western blot 然後現在結果出來了不太理想，有幾個問題 1.看paper Ub-protein沒有只是單一條band而已，譬如我的target protein分子量在43kD ，理論上來說它在接上Ub後band會出現在43kD的上方連續好幾條band，但是我的結果似乎 pattern沒有和paper那麼像，只有兩條band，位置出現在50kD和70kD附近 2.我的Negative control抓到很多很奇怪的雜band，而且有兩條也在我預計想看的 protein相同位置上 跟老師和學長姐討論之後，認為那些band都不是我要看的，簡單來說就是有可能我的 Ab沒有成功把target protein抓下來 目前我想到的解決方式有幾個 1.先用WB測試我的target protein 有沒有被Ab抓下來 2.提高IP反應Protein的量 3.外送Ub plasmid 想請問各位大大們還有甚麼其他意見嗎??? 感激不盡~ --

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