作者yoyukiyo (Green)
看板Biotech
標題[求救] 膠體純化的回收率低
時間Wed Dec 2 02:06:08 2015
最近在做cloing
要將1k左右的片段接到vector上
目前的做法是切10ug的insert
跑膠分離後切下要的片段進行膠體純化
然後我是用GeneMark的kit
目前是一直卡在elute後的O.D值都很低
回溶的體積為25-30ul
但是O.D大概都在20-30ng/ul間
雖然這樣算一算濃度還有將近1ug
但是後續還要進行blunting
表示前面的濃度要高一點
才可以繼續後面的純化...
想請問大家要怎麼提高kit的回收率呀QQ
廠商都標榜回收率將近90%
怎麼我反而是相反= ='''
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1F：推 puddinggg: 10ug去切是指total 10ug嗎？如果vector5k，這樣你原始1 12/02 02:53
2F：→ puddinggg: 0ug切出來完全不lost insert也只有2ug而已 12/02 02:53
3F：→ hitmd: 膠體純化我覺得用kit很看臉，不同品牌在不同實驗室都有不一 12/02 07:52
4F：→ hitmd: 樣的效率 12/02 07:52
5F：推 patricksky: 量很夠了吧? 你總量要下多少做transformation? 12/02 09:53
6F：推 patricksky: 通常vector+insert約1ug 就有clone可以挑了 12/02 10:04
7F：→ yoyukiyo: 是total取10ug去digestion 然後全下跑膠 12/02 11:26
8F：→ yoyukiyo: 我是用學姐的純化方法 然後同樣的kit 學姐就說沒純化這 12/02 11:31
9F：→ yoyukiyo: 麼少= =''' 12/02 11:31
10F：→ yoyukiyo: 因為後續還要用pfu polymerase做blunting 然後再純化一 12/02 11:36
11F：→ yoyukiyo: 次 所以擔心目前的濃度不夠(椅稻･`) 12/02 11:36
12F：→ blence: 你沒有回答到1樓問的10ul是哪裡來,這才是關鍵 12/02 13:34
13F：→ blence: 10ug 12/02 13:35
14F：→ blence: 既然可以知道10ug,想必來源不是PCR產物,而是plasmid這類 12/02 13:38
15F：→ blence: 既然如此,直接用pfu從plasmid以PCR放大,這會不會更方便? 12/02 13:40
16F：→ untilnow: 一塊膠不夠,你怎麼不切兩塊 12/02 17:54
17F：→ Ice9: 要是你的原始plasmid是9K以上，那切下來是那個量很正常啊。 12/02 18:10
18F：→ Ice9: 把那一管水份蒸發一下，就會變濃了。你的blunting是用Klenow 12/02 18:13
19F：→ Ice9: 嗎？對了，片段補平之前，不太建議跑膠純化。 12/02 18:16
20F：→ Ice9: 還有，你寫到「一直卡」……那表示做了很多吧。可以全弄成同 12/02 18:18
21F：→ Ice9: 一管再將水蒸發一下，那不就會有更多更濃的insert了？ 12/02 18:19
22F：推 tony51501: 我覺得20～30ng蠻高的了，我做的insert 1.2kb左右 vect 12/03 11:20
23F：→ tony51501: or 5kb左右，都是從膠上萃下來，之後ligation也成功 12/03 11:20
24F：→ tony51501: 回溶體積32ul 12/03 11:21
25F：推 tynse71864: 濃度低沒關係 還是丟丟看 ligation 機率好中了就中了 12/03 21:54
26F：→ tynse71864: xd 12/03 21:54
27F：→ tynse71864: 死馬當活馬醫 ligation最後要求要10ul我30還是有成功 12/03 21:57
28F：→ tynse71864: xd 12/03 21:57
29F：→ tynse71864: 另外水可以蒸乾或濃縮 12/03 21:57
30F：推 ABULA666: 廠商給的回收率看看就好了...基本上抽不同大小的片段 12/03 22:29
31F：→ ABULA666: 回收率都部會不太一樣，決定回收的效率主要就是看品牌， 12/03 22:31
32F：→ ABULA666: 如果是品質差的牌子怎麼抽都不會好，再來就看你的目標 12/03 22:32
33F：→ ABULA666: 片段多大，人為的差異...我想就一些小技巧可以彌補吧? 12/03 22:34
34F：→ ABULA666: 但決定性沒有像牌子那麼重要 12/03 22:34
35F：推 tynse71864: 大象牌5-7成我覺得差不多 12/04 01:00
36F：推 jimmy80727: 回收少沒關係阿 ligation照作中了就是你的 12/15 09:17