※ 引述《aaa111bb2 (Nate)》之銘言： : Cloning 相關問題 : Vector為10K , RE 相距 9bp, 分別為 SNABI 及 NHEI (Sticky end and blunt end) : NEB, smart buffer 取vector 1ug同時切兩刀 o/n DNA濃度跟純度OK的話,切滿個2 hr就很夠了, 放久有些酵素還會亂切 : Insert 是chromosome PCR product 約 1.1K, 有major band , 而Primer有各預留 2bp 及 6bp. : 跑完0.8%膠, 後進行clean up : 利用NEB Quick ligation (Molar ratio: 1:7) 10 mins insert兩端是blunt end? 是的話接不進去啊... ligation可以作用久一點 : Transformation on ice 20 mins, heat shock 42度 45秒, on ice 5 mins : Add S.O.C medium 500ul and incubation 1h 37度 : 取 200ul 塗盤 能用電穿孔的話, 效率會更高 : 失敗…已經試很多次 失敗是都沒長? 還是長很多vector only? 關係到你後續trouble shooting要往哪 : 沒有任何中繼站 可以進行Check, vector 切完 也看不出來 我會把insert先接到TA vector上, 至少之後切下來後可確定insert兩端是我要的樣子 要找出問題的話, 你要在不同階段多做一些控制組, 不過新手的話, 通常出錯點不會只有一個 : Ligation完 10K->11K 也很難看得出來 : 不知道有沒有高手使用過這兩種RE????或是可以給點建議 因為可能出錯的點太多了, 如果你急著要得到這個clone 我的建議是找附近cloning做得很順的人幫忙, 沒必要卡死自己研究 如果你有好好磨練自己技術跟邏輯的時間跟決心, 那就可以一步步找出問題在哪 Good luck --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 220.142.73.161 ※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1448468342.A.B1F.html