※ 引述《charlene822 (是喔)》之銘言： : 簡單敘述一下我的實驗 : 實驗室研究的某個A蛋白正常為monomer形式存在 : 但加入了B藥物後會隨著藥物濃度增加漸漸形成dimer : 而我想經由Mass知道他形成dimer是哪些胺基酸的片段或位置影響的 : 就我所知可以利用trypsin來做水解特定胺基酸的處理後再上機分析 : 我想請教的是:我們實驗室是用column純化出來的蛋白 需要跑膠處理還是直接可以用純化 : 後加藥的蛋白來做比較? : 如果是的話蛋白濃度以及怎麼加入trypsin處理 還有trypsin的量要加多少? : 小弟對於這方面一無所知 有勞各位大大救命了 感激不盡 小弟從大二到碩二一直都在蛋白質體實驗室做實驗， 以下是實驗室的經驗，給大大參考一下。 再推文裡也有提到過，不管是monomer還是dimer，trypsin都會切， 所以一定要用crosslinker進行處理，如DSP等。 但我很懷疑的是打mass真的可以幫你解決你的疑問嗎? Crosslinked以後只要有Cys都會形成共價鍵，也不能讓你知道dimer的型成是那些 residue所貢獻的。你只能知道經過藥物treatment後dimer的量是增加的。 (可以比較treat藥前與藥後的cross-linked蛋白A的spectra count作相對定量) 要找出那些residues是重要的，只能透過mutagenesis去做。 這是我個人的想法，可惜我才疏學淺，要其他大大幫忙這部分。 在實驗方面，蛋白質要先跑膠還是直接做digestion，其實除了取決於sample的複雜性以 外，還要考慮到digestion的efficieny。 現在做digestion最普遍的方法有兩種，一種是in-gel，一種是in-solution。 前者的efficieny絕對比後者好，原因不太清楚。詢問過蛋白質體中心後， 它們認為原因是peptide在solution中是流動的，這樣會降低peptide與trypsin的 碰撞機率。相反，在膠裡面的話會相對固定，trypsin就比較有機會進行作用。 所以不管sample來源，推薦用in-gel digestion了。 protein量的部分，取決於你LC-MS/MS所用的analyzer是哪一種，我們家最常使用的是 Thermo LTQ orbitrap XL，號稱sub-femtomol都可以鑑定的到。 但實際上也不會用這麼少，我的經驗是SDS-PAGE load 5ug protein都有很好的效果了。 所以簡單介紹一下protocol: 1. Load 5ug protein跑SDS-PAGE 2. Coomassive染色，用水退染一下，band不要太深色。 3. 挖出你要鑑定的band，你可以用tip挖一個圓點做鑑定，也可以挖出一長條band。 4. 如果是長條band的話就把他切成一小塊，大小大概1mm^3，把膠粒放在eppendorf裡面 5. 進行退染，100% ACN dehydrate與25mM NH4HCO3 rehydrate，重複直到膠沒有藍色 6. ACN dehydrate後加入1-2 ul的 20 ng/ul trypsin (dissolved in 25mM NH4HCO3) trypsin的量這樣是一定足夠並多出一些的， 7. 冰上1小時，讓乾掉的膠塊吸取那1-2 ul的trypsin，這時候膠塊會變透明 8. 補上20 ul的25mM NH4HCO3，37度O/N 9. O/N後再補20 ul的NH4HCO3，用sonicater extract peptide 10. 真空抽乾 11. 回溶上機 回溶的部分看你的LC的solution是什麼，我是用12 ul 0.1% formic acid回溶 取10 ul出來放進mass的sample管子裡面，機器會取其中的7 ul打mass --

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