作者ararthur ()
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標題[求救] 關於自製ELISA standard濃度過低的問題
時間Thu Nov 12 14:12:59 2015
各位好，
目前接了一個實驗是設計一個indirect competition ELISA
手上有的東西:
1. human X full-length recombinant protein (欲測蛋白, 非所使用一抗的immunogen)
2. anti-human X mouse monoclonal antibody
(Primary Ab, immunogen為另一來源的full-length X protein, unknown epitope)
3. anti-mouse IgG1 rabbit antibody (Secondary Ab)
4. Human serum sample
5. Human plasma sample
==
||
ELISA策略是：||-X <-1Ab-2Ab*HRP
|| AG->
先將antigen X coating在ELISA用96-well，blocking，
加入待測物AG 與序列稀釋的X (as standards)，
再加入Primary Ab, Secondary Ab, TMB substrate, stop,
Count OD at 450nm by ELISA reader.
如若加入的sample會搶走Primary Ab,
則結合在solid phase的X 就會得到比較少的Primary Ab與後續反應的呈色。
([AG]↑，則 OD↓)
==
實驗設計之初，
我titrate primary Ab 與 coating Ag,
得到這個結果
http://0rz.tw/h1S3k (Excel表單，第一個工作表)，
由此表得知coating Ag在250ng/ml時 OD值 Max-min的range最大，
而Primary Ab則在4000x dilution時 OD值 Max-min的range最大，
所以我初步設定coating Ag = 250ng/ml, primary Ab = 4000x dilution.
接著我使用此condition測不同稀釋倍數的human serum sample，
雖然測試點位不多，但也能明顯看到OD隨著濃度上升而下降
http://0rz.tw/h1S3k (第二個工作表)
未稀釋的plasma組 (OD=0.29) 與未加sample的blank組 (OD=2.24)
OD值差距可以拉到將近2.0;
然而我如果使用序列稀釋的 X recombinant protein當作standards
從濃度 3333ng/ml 兩倍序列稀釋，
http://0rz.tw/h1S3k (第三個工作表)
即使加入最高濃度standard, OD值仍然有1.62之高，降不太下來，
與沒有加的blank組 (OD=2.24) 比較起來只相差0.6不到...
而低濃度standard的組別，也幾乎就在2.1上下徘徊，
與blank組也相差無幾，等於可測得濃度的sample range相當小，
運用在不同來源的sample時會窒礙難行。
我下一步可能會把standard的最高濃度再上調，
試試看是否能夠畫出range比較大的curve,
只是相對於其他commercial ELISA kit的standard大多落在 1000pg/ml~100ng/ml,
我所設定的standard濃度已經算是相當高，
再濃下去 我的recombinant protein用量與開銷就得突破天際了...
===
基於以上遇到的狀況，
有幾個問題想請教大家：
1. 除了繼續加大standard用量以外，我應該如何調整實驗condition,
才能把standard濃度拉低 curve仍能維持呢？
2. 這樣的問題是由於standard對coating Ag的競爭性太弱所導致嗎？
可是兩者我都是使用同一種recombinant protein去作，
對打濃度也達到3333ng/ml vs 250ng/ml了，
怎麼3333ng/ml 搶primary Ab 還是搶不過 250ng/ml的呢？
3. 另外有一種有別於competition ELISA的 inhibition ELISA,
是把protein先與primary antibody incubate之後，
再加入well與coating Ag反應呈色，
但我不大了解這樣做的原因，所測的目標是coated protein嗎？
以上，謝謝看完繁雜的文章，
有任何看不懂的地方也請告知，我會再作更仔細的說明，
感激。
台灣隊十二強加油！
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1F：→ lyu0001: 怎不用direct sandwich ELISA 11/19 11:08
2F：→ ararthur: direct sandwich 應該需要兩隻primary Ab, 其中一隻還要 11/21 11:49
3F：→ ararthur: 是conjugated 而且最好還是得要polyclonal 才能有比較足 11/21 11:51
4F：→ ararthur: 夠的epitope可供captured 如果我理解沒錯應該是這樣(?) 11/21 11:52
5F：→ ararthur: 但目前手頭上只有一隻比較可信任的monoclonal Ab 其他的 11/21 11:52
6F：→ ararthur: polyclonal Ab 作WB時那個專一性差得恐怖 Band雜得誇張 11/21 11:53
※ 編輯: ararthur (36.231.94.7), 11/21/2015 12:00:40
7F：→ ararthur: 所以我比較沒有信心使用手頭上剩餘的抗體... 11/21 12:01
8F：→ ararthur: 目前我找到方法 能夠把OD range拉至約1.6 基本上是以我 11/21 12:01
9F：→ ararthur: 內文提到的第三種想法 inhibition ELISA 等成功把ELISA 11/21 12:02
10F：→ ararthur: 建立起來 再上來回文給大家一點參考 11/21 12:02