作者dnye (缺少勇氣..)
看板Biotech
標題[求救] 細胞免疫螢光isotype control很明顯
時間Thu Nov 5 00:52:04 2015
最近在做細胞免疫螢光,
主要是要染膜上的蛋白質,
一抗是Mouse / IgG2b, kappa
二抗則是rabbit antimouse igG接 Alexa Fluor® 488
因此我的ISOTYPE CONTROL就選擇Mouse / IgG2b, kappa,
但是結果出來Isotype control的螢光很明顯,尤其是在核的部分,
我的步驟是先做固定,染一抗,
染完一抗再用triton 100作permeabilization,
之後以4%BSA做BLOCKING,接著染二抗約一到兩小時,
不知道是為什麼結果出來Isotype control的螢光很明顯,尤其是在核的部分,
請各位大大指導一下,
謝謝
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1F：→ tharaohfu: sample是細胞?組織切片? 11/05 01:58
2F：→ tharaohfu: 染膜蛋白也不一定要用到Triton 固定完直接blocking 11/05 02:00
3F：→ dnye: 是細胞,因為最後有用Hoest33258染核,所以才加triton 11/05 02:02
4F：→ tharaohfu: 一抗1hr+二抗0.5hr即可(室溫之下) 11/05 02:03
5F：→ lail: 換別種fix solution? 11/05 04:57
6F：→ dnye: 我是用4%的PFA當固定液，可以改什麼當固定液？謝謝 11/05 11:41
7F：→ dnye: 好，我試試二抗放0.5hr 11/05 11:42
8F：→ lail: 其他細胞染這隻抗體也會這樣嗎？（一樣是你操作的狀況下）； 11/05 12:48
9F：→ lail: 換隻二抗如何？ 11/05 12:48
10F：→ lail: fix solution網路上找找就有，如methanol，但似乎不適用於 11/05 12:49
11F：→ lail: 膜蛋白的染色 11/05 12:49
12F：→ dnye: 我只有這隻細胞，我試試別只二抗看看 11/05 14:44
13F：推 tharaohfu: PFA固定染螢光易有background 建議換固定buffer 11/05 23:43
14F：→ tharaohfu: -20度C的methanol或是acetone都可以 11/05 23:45
15F：→ dnye: 好,我下次試試看,感謝大家,做完再來跟大家報告結果! 11/06 00:23
16F：推 tynse71864: 我會在1抗前permeablize耶 11/07 00:06
17F：→ tynse71864: 另外IgG可以，但不是最好的ctrl, 核內超強訊號不可避 11/07 00:08
18F：→ tynse71864: ，很難去調整你的laser強度 11/07 00:08
19F：→ tynse71864: 你的膜上蛋白是endogeneous還是外送的呢？ 11/07 00:11
20F：→ tynse71864: 若是後者，可用無外送的細胞當ctrl,其次是用IgG,或只 11/07 00:11
21F：→ tynse71864: 下二抗做對照 11/07 00:11
22F：→ tynse71864: 染核我記得只要fix就可以了吧 11/07 00:12
23F：→ tynse71864: PFA易有background,可在blocking時輔以0.2M的glycine, 11/07 00:15
24F：→ tynse71864: 可避免殘留的醛基對後續實驗的影響 11/07 00:15
25F：→ tynse71864: 洗的時間拉長也可（我是10min*3次 11/07 00:15
26F：→ lail: 我以前染核蛋白用aceton固定即可 11/09 00:27
27F：→ dnye: 各位大大，我今天加一個單獨二抗，結果背景蠻明顯，所以二 11/10 19:53
28F：→ dnye: 抗有問題 11/10 19:53
29F：→ Ice9: 所以你的實驗組呢，細胞核没訊號嗎？ 11/10 22:16
30F：→ dnye: 實驗組也是有訊號的，只是只加二抗的背景值就已經很高了 11/10 23:06