作者hsinhsien (HH)
看板Biotech
標題[求救] PPAR gamma IHC染色方法
時間Mon Oct 5 09:14:16 2015
各位學長姐好
不知道有沒有人染過PPAR gamma的IHC(可見光或螢光)
我已試過無數種方法卻還是沒有成功
讓我人生陷入困境
以下為我的可見光染色方法
希望有經驗的學長姐能過指點迷津
(若因實驗方法不希望被公開，麻煩站內信我)
1.脫蠟(不在贅述)
2.煮片：10mM sodium citrate buffer pH6.0煮65度1小時
我同時也有試過以commercial的鹼煮65度1小時
3.冷卻20分鐘
4.PBST洗3次
5.blocking：1%BSA+1%goat serum 30分鐘
我同時也有試過+10%goat serum
6.一抗(1:100)4度冰箱overnight
7.回溫30分鐘
8.PBST洗5次
9.二抗(1:500)30分鐘
10.PBST洗5次
11.DAB呈色5分鐘
12.ddH2O終止反應
13.Hematoxylin 2分鐘
14.PBS洗
15.烘乾
16.封片
我同時也有試過以trypsin42度煮5分鐘，並利用2%Triton打洞10分鐘
仍然未見效果
希望能給我一盞明燈
謝謝
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1F：→ pandagod: Retrival buufer (citrate)試試看pH9 10/05 15:03
2F：→ pandagod: 另外在retrival完後我會用三次水洗3次然後再用3%或0.3% 10/05 15:04
3F：→ pandagod: 的雙氧水(H2O2)反應10-15分鐘，去除peroxidase避免影響 10/05 15:05
4F：→ pandagod: DAB或者呈色劑(氧化還原成色)受到endogenous的peroxidas 10/05 15:06
5F：→ pandagod: e影響 10/05 15:06
6F：推 osla30: 二抗wash完後，ABComplex可以用用看，放大訊號 10/05 15:15
7F：推 abcam: 我不建議ABC方法……放大的 根本是二抗，不是放大一抗 10/05 20:07
8F：→ abcam: 偽陽性機會 很大吧～ 10/05 20:08
9F：→ abcam: 你可以 問問市面上 賣針對IHC二抗廠商的意見～ 10/05 20:09
10F：→ abcam: IHC的trouble shotting 真的要有經驗的人 比較幫忙快 10/05 20:10
11F：→ jabari: 有沒辦法改用冷凍染IFA? 我覺得IHC每批染濃淡不一也很討厭 10/05 20:13
12F：推 abcam: IHC的染色 絕對有深淺之分的不是 0與1 的兩瞪眼 染色 10/05 21:08
13F：→ osla30: 但二抗不就接一抗，話說我自己染alpha-synuclein也失敗好 10/05 22:35
14F：→ osla30: 久，dab、螢光各種也都試了>< 10/05 22:35
15F：→ hsinhsien: 3%H2O2也試過了，沒有，唉 10/06 10:13
16F：推 pandagod: 一抗決定IHC的品質，若二抗或呈色方式都試過了，可以考 10/06 11:28
17F：→ pandagod: 慮換隻抗體，另外要買哪隻抗體，多爬爬別人的論文，參 10/06 11:28
18F：→ pandagod: 考一下他們的方法，如果雷同就鎖定抗體型號，在爬更多 10/06 11:28
19F：→ pandagod: 文，越多人用買回來可用的機率越高...另外可以找染不出 10/06 11:28
20F：→ pandagod: 來可以包退貨的廠商購買抗體 10/06 11:28