作者lb00202549 ()
看板Biotech
標題[求救] RNA level與protrin level結果相反
時間Wed Sep 2 23:37:23 2015
菜到不行的碩一新生的我最近剛跑完同一批cell line的QPCR以及western
結果發現在cancer cells中的RNA level所想看的x gene的CT值很高，幾乎沒有表現。
而western protein level的結果卻是皆有表現。
請問這種結果合乎邏輯嗎?
新手的我實在想不太到這兩者之間發生了什麼事(暫時排除人為技術><)
有稍微跟跟我一樣菜的同學討論了一下
同學說可能原因是:
1.RNA容易degrade，可能沒有測到。
2.有其他機制去影響x protein的表現。
再來還有什麼可能的原因呢? 謝謝!!!
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 111.243.117.119
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1F：→ blence: 這哪是相反了，有沒有適當的control怎麼是相反 09/02 23:39
2F：→ lb00202549: 不好意思!我用字不恰當>< 09/02 23:40
※ 編輯: lb00202549 (111.243.117.119), 09/02/2015 23:40:53
3F：→ blence: 你把現有抗體倍率再稀釋一千倍,WB結果不就跟QPCR一樣了阿 09/02 23:40
4F：→ lb00202549: 但是無論QPCR或是western的internal control都很清楚 09/02 23:42
5F：→ blence: 等你用很多株細胞再來說WB與QPCR是不是一致 09/02 23:47
6F：→ blence: 現階段的data把該抗體再多稀釋一千倍,WB就很QPCR一樣弱了 09/02 23:49
7F：→ huuban: RNA quality OK嗎？ 09/03 00:09
8F：推 ljii: 呃...這是常見到不能再常見的狀況了 09/03 05:50
9F：→ ljii: 照你的說法是RNA測不到, protein測的到. 所以可以從RNA leve 09/03 05:51
10F：→ ljii: l及protein level各去想. 各自有無數可能 09/03 05:51
11F：→ ljii: RNA level :RNA sample quality? primer melting curve?換 09/03 05:52
12F：→ ljii: 組primer?RNA有沒有被DNA 污染?搞不好RTPCR產物跑膠是一個 09/03 05:53
13F：→ ljii: smear 09/03 05:53
14F：→ ljii: protein level: 你確定你blot到的是那個protein嗎?別的lane 09/03 05:53
15F：→ ljii: 也blot的到?有positive control嗎?(確定有表達該protein的 09/03 05:54
16F：→ ljii: cell line) 09/03 05:54
17F：→ ljii: 另外你的"皆有表現"也講的很含糊, western出來是一個 09/03 05:54
18F：→ ljii: big fat band, 還是是好幾條然後剛好有一條命中你預期的分子 09/03 05:55
19F：→ ljii: 量你就覺得是有表達?表達量跟loading control比呢? 09/03 05:55
20F：→ ljii: 假如上面troubleshooting都作完了, 確實是RNA表達量很低 09/03 05:56
21F：→ ljii: 但protein量高, 那可能就是有別的gene在作這個protein或是 09/03 05:57
22F：→ ljii: 剛好作一個類似大小又類似epitope的fragment (抗體好不好也 09/03 05:57
23F：→ ljii: 有差). 09/03 05:57
24F：→ ljii: 最後加個不負責任的預測,因為你說你RNA的Ct很高, (高是多少? 09/03 05:58
25F：→ ljii: 35?38?) 我會猜是你根本就是primer不好,換幾個primer試試吧 09/03 05:58
26F：推 ducky313: 這好多原因，三言兩語也說不完...另外可能還有時間點的 09/03 10:17
27F：→ ducky313: 問題哦.. 09/03 10:17
28F：→ lb00202549: 請問時間點是什麼意思呢？ 09/03 11:10
29F：→ liumang: mRNA→protein這段時間也是要考慮的啊 也許你雖然測的到 09/03 20:55
30F：→ liumang: protein 但mRNA早就degrade掉了啊 跟你一樣是小碩一 有 09/03 20:56
31F：→ liumang: 錯還麻煩指教一下 09/03 20:56
32F：推 qiet: 先保證你的實驗condition是ok的再來考慮科學問題 09/03 23:42
33F：→ qiet: RNA品質, primer/qPCR條件(是否有好的positive control) 09/03 23:43
34F：→ Ice9: probe 是自行設計的嗎？搞不好 probe 也有問題呢。 09/04 10:34
35F：→ Ice9: 另外，你可以先看看你的mRNA，上面有没有早夭序列…… 09/04 10:36
36F：推 andy544asd: 蛋白如果在細胞裡面很穩定不容易降解 就算mRNA都消失 09/09 23:04
37F：→ andy544asd: 原本的蛋白質還是不會消失阿 就頂多沒有新生成更多 09/09 23:05
38F：推 ararthur: primer換一組吧 或許根本沒抓到 09/28 02:22