作者lxz (夢與天空交織的瞬間)
看板Biotech
標題[討論] Stripping對磷酸化蛋白的影響？
時間Fri Aug 14 18:43:05 2015
各位先進好
小弟最近在跑磷酸化蛋白的western blot
前天照出來的結果因為不是很好看，所以將membrane strip之後重新染一抗跟二抗
(stripping buffer是thermo的，我室溫strip 10~15分鐘之後，用1x TBST wash三次)
但重新染得這次用來配抗體的buffer不一樣，一抗濃度我也稍微提高了一些
(我用某公司提供的signal enhance buffer的sample來配一抗)
(一抗從1:1000提高到1:700)
結果如下
Stripping前（框出來的是我的target band）
http://imgur.com/T7aNvzR
Stripping後
http://imgur.com/BZ1xMOg
結果很詭異的是，Lane2濃度增強，Lane3濃度減弱
雖然這才是我要的結果，但stripping之後有這樣的改變我是第一次遇到
不知道版上的先進是否有什麼建議或看法呢？
變因有三個 1.buffer 2.抗體濃度 3.Stripping
我也會再跑一次試試看，用相同濃度相同buffer去看看是否會有一樣的結果
謝謝
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1F：推 tynse71864: 我之前strip過 東西就全沒了 ˊ_>ˋ 08/14 20:02
會不會是strip太久@@?
2F：→ blence: 你重染同一支抗體還需要strip嗎？ 08/14 20:38
因為我怕二抗影響新的一抗，所以習慣上會Strip之後再染一次，所以可以不用strip嗎?
3F：推 moon0126: stripping的時候buffer加不夠，搖晃不均勻？ 08/14 22:22
我比較怕我用太多XD
※ 編輯: lxz (111.250.106.64), 08/14/2015 22:26:42
4F：推 tz2733: 兩次拍攝得背景值差好多...第一次的lane3本身背景也比其他 08/16 01:47
5F：→ tz2733: lane較亮 不知統計扣除背景值後是否有比lane2高.而第二次 08/16 01:47
6F：→ tz2733: 拍攝背景每條lane比較一致 建議還是重作第二次條件再看看 08/16 01:47
7F：→ tz2733: 吧 加油! 08/16 01:47
我用imageJ統計過，第一次的Lane3確實比2高，我會重做第二次的條件，謝謝^^
8F：→ Ice9: 第一次的背景真髒？用什麼blocking的，不會是 milk 吧？ 08/16 07:30
9F：→ Ice9: 另外，如何知道你 strip 乾淨了？可有strip後重染前的影像？ 08/16 07:31
10F：→ Ice9: 一般測磷酸化的WB，不太建議重染。stripping 會減低磷酸化蛋 08/16 07:33
11F：→ Ice9: 白的偵測，signal 降很多。 08/16 07:33
我是用5% BSA去blocking，Stripping是根據buffer裡說明書建議的時間去做，做過三次
確定有乾淨。
Strip後重染前？是指strip後的membrane的影像嗎？
我也在想是不是stripping造成磷酸根掉了QQ
※ 編輯: lxz (111.250.106.64), 08/16/2015 12:43:28
12F：推 tynse71864: 我第一句就是說這個啦ˊˋ 08/17 01:16
13F：推 icome: 不是strip造成的 第一次背景太高 不能當作result 08/21 10:26
來update一下
我後來用5% BSA配抗體，抗體用1:750，成功看到我要的結果，還沒試過stripping之後
是不是也會看到一樣的結果，但看起來應該是抗體濃度的原因。
謝謝大家:-)
※ 編輯: lxz (111.250.99.20), 08/23/2015 08:35:21
14F：推 HaGa5566: 建議先壓磷酸化的 08/27 21:15