作者grassshan (紙飛機啊歐歐踢欸死)
看板Biotech
標題[求救] western 轉漬效果差?
時間Wed Aug 5 14:40:29 2015
細胞種類:分化9天完成的3T3-L1細胞
Protein Loading 量: 100ug
抗體: C/EBP alpha、PPARgamma (Stant Cruz.)
我最近在測試抗體比例，先抓了100ug的最大Protein量去測試
但低到1:200的比例出來都是白片，
重新Hy actin 卻是有東西的(但Band沒有很粗)
我後續有查膠染coomasin blue
membrane 染Ponceau S
結果如下:
http://imgur.com/fTjXYbb,wC4sj4c#1
http://imgur.com/fTjXYbb,wC4sj4c#0
之前因為轉漬效果不好，
(之前使用200mA 2hr 埋冰放在4度C冰箱中)
有跟老師討論改在中間放個磁石,
然後包埋冰的情況下 室溫 200mA 2hr
但這結果看來，是不是依舊轉漬效果差呢?...
我有試著將電壓上調到300mA
但我們家電壓器好像上不去,一直顯示Error
我加了半個小時的轉漬時間,但還是不是很妙．．．
想請問各位大大～
還有什麼改善的方法呢？
此外,ECL 我們家使用的牌子是Thrmo的
看protocol 顯影時間3min
但我照完一次冷光,想橋位置直接重新照的時候,就又是一片白了@_@
(過程大概5分鐘內)
這樣要照是再用ECL反應一次嗎?
我有聽說反應太久會燒片 還是白片？
但我現在寧願燒片也不想要再看白片了..
然後有需要補充的地方，歡迎大大指教>_<
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1F：→ grassshan: C/EBP alpha分子量37.5 PPARgamma分子量52 08/05 14:45
2F：→ felix0330: 下次加跑 marker，看起來不像 100ug protein 的量，可 08/05 16:25
3F：→ felix0330: 能蛋白質定量有問題 08/05 16:27
4F：→ grassshan: 是多跑幾條marker的意思嗎@_@? 08/05 20:07
5F：推 tynse71864: 轉漬看起來蠻正常的耶 我家也4度轉 08/05 20:31
6F：→ tynse71864: 可能是lysate處理的問題 （？ 08/05 20:32
7F：推 lyu0001: 1A 1hr 08/06 08:02
8F：→ alex53001: transfer buffer要不要交叉試試看(換別家or重配） memb 08/27 02:58
9F：→ alex53001: rane是什麼? 是不是PVDF然後沒泡MeOH 依我的經驗 200mA 08/27 02:58
10F：→ alex53001: ,2hr對於你這個分子量很ok 08/27 02:58