作者shinchenboy (欣承男孩)
看板Biotech
標題RNA stability 測試
時間Thu Jul 30 11:59:07 2015
各位大大們好
最近小弟的實驗開始做到mRNA stability的測試
主要的實驗策略就是將Actinomycin D加入MCF7細胞中抑制mRNA生成
然後受各個時間點的RNA來做qPCR
來觀察RNA降解的情形
小弟有幾點細節不太了解所以想來釐清下
1.是細胞剛Seeding完就可以加入Actinomycin D，還是要等細胞都貼附
，隔天在加藥???
2.加入Actinomycin D之後大概是要等多久開始收RNA呢???
3.在小弟以往的實驗中在上qRT-PCR之前是一定要把所有RNA sample的濃度和量
調成一致，跑完qPT-PCR之後也會把每個RNA的Ct去對GAPDH mRNA的Ct去做校正，
目的就是為了讓每個RNA sample是在相同的量下作為基準才能真正比較出在不同
condition下RNA表現量的差異，那這樣的話在RNA stability的實驗中，每個時間
點的total RNA的表現量理論上來說應該是會隨著時間的增加而減少才對，所以
這樣的話把每個時間點的RNA收下來之後要把大家的量調成一致在上qRT-PCR嗎???
跑完之後來要對GAPDH進行校正嗎???
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1F：推 chaunen: 一般看到都是: 1.隔天 or 50% or 90% 開始加藥 2.最多24h 07/30 12:23
2F：→ chaunen: 內, 5ug/ml 3. 我覺得你對 有錯樓下請指正 3Q~ 07/30 12:24
3F：推 mesenchymal: 2.大部份都24h內 3.可以試著用2-3種HF相對長的genes 07/30 12:36
4F：→ mesenchymal: 當internal controls, 如(18s rRNA, beta actin...) 07/30 12:37
5F：推 mesenchymal: GAPDH也有人用,但你可以先測試找出最適合的 07/30 12:41
6F：→ Ice9: 建議還可以參考文獻中和你使用同一種細胞的人，在 mRNA sta- 07/30 13:40
7F：→ Ice9: bility 實驗中的實驗條件做比對。 07/30 13:40
8F：→ Ice9: 另外就是，只考慮 Act-D 嗎？ DRB 和 alpha-amanitin 呢？ 07/30 13:47
9F：→ Ice9: 如果我記得没錯，有些實驗連 translation inhibitor 都會加 07/30 13:48
10F：→ Ice9: 當然，這都要看你的實驗需求。 07/30 13:48
11F：推 Ianthegood: D很好用是它便宜而且specificity很高 可以用pol I 07/31 09:49
12F：→ Ianthegood: 或 III 當control.或是取固定量細胞做絕對定量 07/31 09:50
13F：推 ararthur: ActD蠻普遍 應該先試試它沒錯 08/03 00:44
14F：→ ararthur: 問題3其實是在一個假設下：你的treatment對於細胞可能造 08/03 00:45
15F：→ ararthur: 成部分 (但不是大部分)的RNA stability改變 所以你依舊 08/03 00:46
16F：→ ararthur: 可以先在RT前用同樣的RNA amount去做 qPCR也用相同體積 08/03 00:46
17F：→ ararthur: 的cDNA去amplify 08/03 00:47
18F：→ ararthur: 所以比較可信的並非是ActD-treated mRNA half-life time 08/03 00:48
19F：→ ararthur: 而是在各個時間點 treatment組與control組的ratio 08/03 00:49