作者polomi (polomi)
看板Biotech
標題Re: [求救] PCR定序結果 forward跟reverse完全不同
時間Mon Jul 6 11:24:06 2015
不好意思，前兩天學校大停電~
整個都呈現無電狀態@@
現在才看到大家的回覆~~
→ Ice9: design another forward primer to read through the end… 07/02 17:46
→ roy047: reverse亂黏, 可重新設計或是同一樓 07/03 14:54
其實我一開始是先用定序公司提供的序列，
現在已有在設計一段序列使用，
等待重新定序。
→ xxtomnyxx: Reverse 的定序 AB1 圖是單一 peak 但是序列都不對嗎？ 07/03 22:09
從revers端去看幾乎都是錯置的，
貼圖一下
http://imgur.com/xMLIa7H,3tmnlfv#1
長度偏短，
且幾乎都是錯置居多。
而forward端
則是
http://imgur.com/xMLIa7H,3tmnlfv
長度為1050 bp，
除了前後端外，
幾乎都是單一paek，
而且符合我的預期結果。
→ blence: 看起來insert超過1k？ 07/04 00:26
送入片段為 1092bp
→ supray: 可能你的reverse primer有多個binding site吧? insert中有 07/04 23:46
→ supray: 相似序列? 07/04 23:46
應該是不會
1. M13F (-40) 5'-CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3'
2. M13R(-48) 5'-AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GG-3'
3. M13F(-20) 5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3'
4. M13R(-24) 5'-AAC AGC TAT GAC CAT G-3'
有比對過，
專一性都算滿高的~
→ supray: 同一樓 從已定出的序列設計新primer 07/04 23:49
恩恩，
希望這次的定序會準一些 QAQ
上次超神挑的，
1/5的機率也能讓我挑到錯誤的位置，
回來比對整個傻眼了。
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1F：→ Ice9: 你兩張圖都一樣啊～ 如果reverse的圖就是那樣，那是肯定没有 07/06 14:32
2F：→ Ice9: 問題的。要不要拿去 blast genome bank 看是什麼東西？ 07/06 14:33
3F：→ Ice9: 還有，如果所有條件都非常好，其訊是有可能讀到1K以上正確訊 07/06 14:33
4F：→ Ice9: 號的。我以前曾到到過少少的兩、三次。雖然訊號很弱，但都不 07/06 14:34
5F：→ Ice9: 會互相干擾。 (我是指1K附近的訊號很弱) 07/06 14:35
7F：→ Ice9: 看來不是 primer 就是 plasmid 有問題啊。訊號很多…… 07/07 17:59
8F：推 satasumi: revers的primer應該污染了 05/13 00:29