作者shinchenboy (欣承男孩)
看板Biotech
標題[求救] pcDNA3.1(+)stable clone建立
時間Thu Jun 11 13:32:36 2015
各位版友大大們好
最近小弟的實驗要開始建立以pcDNA3.1(+)為載體的Stable clone MCF7細胞株
建立的方式參考學長姐的實驗記錄以及pcDNA3.1(+)的產品資訊
主要的方法是先把pcDNA3.1(+) transfect到MCF7細胞之後
隔24小時後有收一些細胞下來觀察transfection有無成功
然後剩下的細胞則是繼續培養在含有抗生素G418的medium中
來篩出stable clone出來 每2天要換一次medium 大約要篩2週
G418最後在細胞中的濃度是1ug/ml(此濃度是參考畢業學長姐的論文)
根據RNA定量的結果證實transfection是有成功的
但是剩下來培養在含G418的細胞卻發生以下的現象:
1.一開始剛加G418的時候好好的，隔天看細胞發現細胞有凋亡大約5成，再隔天看
發現細胞凋亡大約到7成了...(存活下來的細胞只剩3成)
2.後來我換了一次medium，重新加入G418，隔天再看一次細胞，發現已經凋亡了約9成
，再隔天看一次細胞，發現存活下來的細胞屈指可數......
想要問版友大大們這樣的現象是正常的嗎?
我的理解是加入G418最主要的目的是為了要殺掉沒有被成功transfect的細胞
讓有成功transfect的細胞存活下來
但是今天我的細胞再加入G418後幾乎都死光光了
可是從RNA定量的結果來看我pcDNA3.1(+)應該是有成功送入MCF7才對
所以會不會是以下兩個問題
1.G418加入的濃度過高:加入的濃度條件是我參考學長姊的畢業論文，他們用的plasmid
和細胞都和我一模一樣，所以我想說這個濃度應該是很適當的才對
2.選用的抗生素不恰當:pcDNA3.1(+) vector內包含抗Neomycin的基因，G418是Neomycin
的衍生物，所以我想說應該也不是這個原因才對
拜託了各位大大們 小弟會感激不盡
小弟我好想要趕快畢業阿QQ
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1F：→ a90648: stable clone是指你送進去的plasmid有插進genome中 06/11 13:58
2F：→ a90648: 數量本來就不會太多了，不會你的細胞我沒使用過所以不知道 06/11 13:59
3F：→ a90648: 一般狀況下成功率有多少 06/11 13:59
4F：→ a90648: 而且你一開始送進去後抽RNA轉RT去看結果基本不准 06/11 14:00
5F：→ a90648: 即使有處理DNaseI還是有很高機會去P到plasmid 06/11 14:01
6F：→ a90648: 要確認的話我們實驗室一般是用western或是co-transfect 06/11 14:04
7F：→ a90648: GFP plasmid 06/11 14:04
8F：→ a90648: 細胞有亮基本上就表示有transfect成功，但是要變stable 06/11 14:05
9F：→ a90648: 還是會因為細胞不同成功率會差很多 06/11 14:06
10F：推 FYT0429: G418的使用濃度你可以先用96孔盤來測試， 06/11 14:48
11F：→ FYT0429: 找到lethal concentration再往下調100~200 ng/ml 06/11 14:49
12F：→ FYT0429: 有時候這些東西在不同人手上就是不一樣，玄玄der 06/11 14:49
13F：推 MDCCLXXVI: 用G418 ok 06/11 18:50
14F：→ blence: 你把transfection成功當做是stable candidate了,其實差異 06/11 19:22
15F：→ blence: 很大,如果G418加了不會死,那當初就不需特別用G418篩了阿 06/11 19:24
16F：→ blence: 你這裡的G418不只是殺"沒有被transfect"的細胞,而是要殺 06/11 19:29
17F：→ blence: non-integrated"的細胞,所以才會被稱為stable clone 06/11 19:31
18F：推 wanderchang: 私以為stable clone 至少是一個月的事？需要讓時間 06/11 20:30
19F：→ wanderchang: 把transient， not-so-stable 跟stable clone區分開 06/11 20:30
20F：→ wanderchang: 來 06/11 20:30
21F：→ Ice9: 你的問題2很嚴重啊。我覺得有些東西你不弄清楚，還是緩點畢 06/12 08:51
22F：→ Ice9: 業的好。 ps. 一個是 phosphotransferase 一個是antibiotic 06/12 08:55
23F：→ Ice9: 嘖！抱歉，我眼殘了。自打臉～～ 06/12 08:57
24F：→ Ice9: 我個人是覺得你transfection可能並没有你想像來得高。一是用 06/12 09:02
25F：→ Ice9: a90648網友說了的，你測試的手段太單一，而且可信度可能不大 06/12 09:03
26F：→ Ice9: 二是你的control組的死亡率如何？我猜也和你的實驗組一樣的 06/12 09:04
27F：→ Ice9: 速度。這樣可能問題並不在selection本身，而是細胞有問題。 06/12 09:05
28F：→ Ice9: 而且，用1ug/ml 來篩選，壓力太小了，如果tranfect成功，不 06/12 09:06
29F：→ Ice9: 太可能一開死就死一大票。1ug/ml比較像是maintain時的濃度。 06/12 09:07
30F：→ blence: 我猜是寫錯了,應該是1mg/ml,就算maintain也至少要50ug/ml 06/12 10:18
31F：→ blence: 我們MCF7用的是300-500ug/ml這個範圍 06/12 10:19
32F：推 MDCCLXXVI: 質體的品質ok嗎？濃度有跑膠確定嗎？有時機器測不準 06/12 12:21
33F：推 chaunen: 推樓上~若質體supercoil的比例低, transfect的比例會大降 06/13 01:38
34F：→ chaunen: 若表現的是原先MCF7沒有的基因, 跑QPCR會很明顯 06/13 01:39
35F：推 chaunen: 即使只有少數的細胞有表現 06/13 01:43
36F：推 chaunen: 可以1.test transfection condition (拿個表現GFP的質體) 06/13 01:48
37F：→ chaunen: 2.同M大 檢查質體quality(100ng 跑個1% agarose gel) 06/13 01:52
38F：→ chaunen: 3. 正在select的MCF7如果還沒死光, 就繼續篩(大概2-4周) 06/13 01:55
39F：→ blence: 其實沒必要探討supercoil與test condition,stable不講求這 06/13 10:48
40F：→ blence: 些,而是integration,所以才有linearized plasmid for 06/13 10:50
41F：→ blence: stable transfection的嘗試;transfect再好細胞也是死一堆 06/13 10:55
42F：推 chaunen: transfection效率高integration 也會比較高吧? 06/14 00:17
43F：推 chaunen: 跑膠看supercoil的比例只是要驗證這管plasmid的品質, 06/14 01:02
44F：→ chaunen: 排除gDNA,RNA汙染外,一般來說supercoil比例應該最高 06/14 01:03
45F：→ chaunen: 比例低則可能已經產生nicked form 並不適合transfection 06/14 01:03
46F：→ chaunen: B大提到的linearized plasmid是會增加integration沒錯 06/14 01:04
47F：→ chaunen: 但前提是plasmid DNA 品質好的條件下. 06/14 01:04
48F：推 chaunen: 除了plasmid品質外,我想transfection condition也蠻重要 06/14 01:21
49F：→ chaunen: 照原PO的結果來看, 推測transfection效率可能不佳, 06/14 01:21
50F：→ chaunen: 導致細胞一下子就死光,幾乎沒有細胞撐過transient stage 06/14 01:22
51F：→ chaunen: 更別說integrate到gemone的比例又更少了... 06/14 01:22
52F：→ chaunen: 不過我有點好奇, 原PO該不會加到puromycin了吧... 06/14 01:24
53F：→ chaunen: 以上只是個人看法, 有錯還請指教(抖~) 06/14 01:24
54F：推 tynse71864: 是說 送進去的是單純的vector嗎 還是有其他的表現pr 06/14 12:07
55F：推 tynse71864: protein 06/14 12:09
56F：→ tynse71864: 我之前做tf (用puro）最後大概剩一成吧 還是能挑 06/14 12:10
57F：→ shinchenboy: 我確定我是加G418 然後篩選濃度我打錯了 是1000ug/ml 06/15 10:22
58F：→ shinchenboy: 然後我送入空的vector或是有insert外來序列的vector 06/15 10:24
59F：→ shinchenboy: 一樣在加入G418之後幾乎是死光的狀態 我覺得有可能是 06/15 10:26
60F：→ shinchenboy: 我transfection的過程就沒有成功 plasmid的品質我會 06/15 10:28
61F：→ shinchenboy: 跑膠去測試 謝謝各位大大們的建議 小弟感激萬分 06/15 10:29
62F：→ Ice9: 呃，你應該也要有個没transfect的純細胞當對照吧？ 06/15 21:43
63F：推 tynse71864: 有篇Lonza stable clone的protocol可以參考~ 06/17 20:55
64F：推 ararthur: 1mg/ul可能太強了 還是先titrate濃度再看看吧 而且有些 07/23 16:01
65F：→ ararthur: 時候是transfect完後先多養兩天再開始Selection 讓他有 07/23 16:02
66F：→ ararthur: 點時間表現resistant gene 否則即使有transfect進去也會 07/23 16:02
67F：→ ararthur: 被你掛掉 至於integrated與否 應該是selection後期的事 07/23 16:03