作者baal90317 (夢夢夢夢想家)
看板Biotech
標題Fw: [問題] 關於整個qPCR的trouble shooting
時間Sat May 16 11:10:34 2015
※ [本文轉錄自 Biology 看板 #1LLhJMb3 ]
作者: baal90317 (夢夢夢夢想家) 看板: Biology
標題: [問題] 關於整個qPCR的trouble shooting
時間: Sat May 16 11:09:08 2015
【問題】：從細胞中取RNA到轉成cDNA到最後跑qPCR可能出問題的步驟和確認方法
【問題起因】：1.qPCR出來的結果不太正常,要如何學習去找出問題的根源
首先 取RNA時 要先確保RNA不會被降解 過程中的小細節不提
取完之後到跑qPCR之間 有哪些方法可以知道自己取出來的RNA有沒有
問題呢?
2.用kit(invitrogen)取出的RNA 280/260的值很好(~2.0)
可是260/230卻很糟 (~0.5)過程我也沒用有機溶劑
用kit的可以用酒精洗嗎?
【個人看法】：取完之後先用nanodrop看 280/260 和 260/230的 O.D.值
但是就算O.D.值沒有問題 RNA有可能斷成小片段而不知道
導致最後qPCR的結果不好 (melting curve沒問題)
因此中間可能要用跑膠的方法去確認RNA的完整性 但是我大學科系
非生科背景 原理懵懵懂懂 不知道跑膠該設那些組別來跑
跑cDNA和跑RNA各有那些優缺點也不知道 學長姊也都非生物背景
大致上都不知道 (是生物背景的也沒做PCR)
可以請各位給些建議看的書籍和一些建議嗎? 謝謝!!!
【參考資料/連結】：
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.113.136.221
※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biology/M.1431745750.A.943.html
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
※ 轉錄者: baal90317 (140.113.136.221), 05/16/2015 11:10:34
1F：→ jabari: 啥?? 你的問題是?? 05/16 17:04
2F：推 jabari: 用kit260/230的問題 根本原因是你加wash buffer時沒有轉一 05/16 17:06
3F：→ jabari: 轉. 這在protocol沒有寫 但在網路已討論很久. kit裡面鹽 05/16 17:07
4F：→ jabari: 的部份殘留column內 所以在wash步驟稍微讓整個管壁都浸潤 05/16 17:07
5F：→ jabari: 到buffer.最後260/230就會正常 05/16 17:07
6F：推 jabari: 另外想知道有沒問題 你該選用qubet或是上agi2100看RIN值 n 05/16 17:09
7F：→ jabari: anodrop其實看不清RNA的品質 05/16 17:09
8F：→ jabari: 如果真的想讀 我建議你翻實驗室NEB舊的catalog 05/16 17:10
9F：→ jabari: 或是看protocol online 裡面積滿古人的血淚 05/16 17:14
10F：推 huuban: 一般的跑膠很夠了啦，不過如果有錢用2100當然最好 05/16 18:57
呃 大概是 如果懷疑取出的RNA可能被RNAase切成小段
在跑PCR之前要用什麼方法來確認會比較好呢? 謝謝!
大致上是知道要跑膠 只是要怎麼跑會比較好呢 @@
什麼是primer的postive control.. 謝謝
※ 編輯: baal90317 (111.243.65.124), 05/16/2015 20:49:03
※ 編輯: baal90317 (111.243.65.124), 05/16/2015 20:51:46
11F：推 tigernaxo: 怎麼跑？不就跟DNA一樣 看rRNA還在不在 05/18 10:08
12F：→ sylvialalala: 怕rna斷成小片段的話，跑膠看有沒有smear 05/18 10:12