作者babylikeg (殞落星痕)
看板Biotech
標題[求救] plasmid中特定基因片段置換?
時間Fri May 1 11:28:41 2015
最近boss想做一個project
主要是研究某段基因對於藥物抗性的影響
實驗中用到的質體
屬於T5 promoter
其中的antibiotic resistance gene屬於Amp resistance
但本身我們在做Drug resistance的目標也是Beta-lactam
篩選所使用的抗生素會影響實驗結果
想把amp 抗性換成 其他抗生素篩選基因
苦於小弟沒做過mutagenesis...
boss也不太願意添購新的plasmid
想請問一下板上先輩，有甚麼方向可以嘗試?
可以點出，小弟再去搜搜看相關文獻方法來嘗試!
感謝各位提點
祝各位順順利利的~實驗也都有好Data!!!
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教授念經何時了 靠妖期末考
室友昨夜又春風 好人不堪回首數卡中
學長筆記應猶在 只是課本改
問吾能有幾多囧 不多不少正好五十九
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 163.20.181.88
※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1430450924.A.1C5.html
1F：→ milkpa: 實驗室有抗其他抗生素的plasmid嗎，拿來換一換就好了 05/01 11:49
2F：推 licat: 查有沒有適合的酵素切位把amp gene切掉 接別的進去就好 05/01 11:51
有Kanamycin、chloramphenicol的抗性載體
amp resistance前方緊黏T5 promoter
還是只要把AMP部分截掉就好了??
※ 編輯: babylikeg (163.20.181.88), 05/01/2015 12:03:02
3F：推 liuse: 沒RE的話可以設計homologuous recombination換進去 05/01 15:01
4F：→ liuse: 但要在特殊E. coli strain 05/01 15:02
5F：推 eric1210: 先把map調出來 ，應該會有可切掉amp的位置 ，切掉後由 05/01 15:11
6F：→ eric1210: 其他plasmid的抗生素片段來塞進去 05/01 15:11
7F：→ eric1210: 切掉amp部份就可以 ，T5不用 05/01 15:12
8F：→ Ice9: 我想到的是類似 liuse 的作法：將Amp vector 和要製換的XXX 05/01 17:23
9F：→ Ice9: vector 放在一起。設計 forward primer 前半段在 amp vector 05/01 17:24
10F：→ Ice9: 上，後半段在 xxx 抗生素的 5'-end 上，然後 reverse primer 05/01 17:25
11F：→ Ice9: 的前半段在 amp 3'-end 之後的原 vector 上，後半段在 xxx 05/01 17:26
12F：→ Ice9: 抗生素的 3'-end 上，當然要比一般 primer 要長一點。然後拿 05/01 17:28
13F：→ Ice9: 去 PCR amplify。最後3種 plasmid 的大小應該有差，切膠分離 05/01 17:29
14F：→ Ice9: 要不然拿 DpnI 處理過是最好。 05/01 17:31
15F：→ Ice9: 最後再拿去 transform 量產和定序。 05/01 17:32
16F：→ Ice9: 咦，不對，這樣會有四種 plasmid 。把 xxx vector 先用RE切 05/01 17:34
17F：→ Ice9: 到包含 xxx 抗生素 DNA 的最小片段，分離純化，再和含 amp 05/01 17:35
18F：→ Ice9: 的 vector 放在一起進行 PCR 量產。 05/01 17:35
19F：→ blence: 我用過上面的方法塞入最長1.5k,同時踢掉幾10bp,不過是先放 05/01 18:36
20F：→ blence: 大xxx後先純化,再以此當primer以site direct去換amp vectr 05/01 18:41
21F：→ Ice9: 我自己没塞過東西，而是用類似的方法進行同一段 DNA 上不同 05/01 22:31
22F：→ Ice9: 片段的置換，所以想說以前的方法，原 PO 可以考慮。blence 05/01 22:34
23F：→ Ice9: 的方法更簡單，但我們兩者的 primer 設計應該是一樣的。 05/01 22:36
24F：→ Ice9: 而 blence 的方法應該會能省 primer 的設計長度。 05/01 22:40
25F：推 e104582001: 感覺買新plasmid會比同源互換較多錢XD 05/02 03:14
26F：→ e104582001: *省 05/02 03:14
27F：推 chaunen: 可以先上addgene找看看有沒有適合的 05/02 11:03
28F：推 jeol1620: 可以試試看PIPE cloning 可以做deletion,insertion 05/06 22:01
29F：→ jeol1620: 放新的基因要4條引子，deletion,insertion兩條就夠了 05/06 22:03
30F：→ jeol1620: 兩條引子P完用dpnI背景切乾淨直接電穿孔，只是變沒抗性 05/06 22:05
31F：→ jeol1620: colony PCR要多篩一點 05/06 22:05
32F：→ jeol1620: Ice9大大說的感覺是RF-cloning 05/06 22:06