要說的東西太多了，於是索性回文一章。 1. 5'-end phosphate group 你的 PCR product 肯定没有。 至於 vector，要看你手上的 datasheet 是怎麼寫的。 没有 5'-end phosphate group, 你加 ligase 也没用。 要是 vector 有 phosphate group，會大增 vector 自接的可能性。 我以前用過的是 pGEM-T 系列來做 T-A cloning， 上頭的 protocol 有說可以不必再進行 vector 的 dephosphorylation， 顯示 pGEM-T vector 上是有 5'-end phosphate group 的。 它是說 backgroup 低，但低到多少，似乎没提。 Insert DNA 可以在量產並純化後，拿 T4 polynucleotide kinase， 在 5'-end 進行 phosphorylation。 如果你們的 protocol 没有進行過修訂，那表示以前有成功過，而且可 能經常成功， 那表示你們一直使用的 vector 應該是有 5'-end phosphate group 的。 然後再看看你的結果描述，那個 background 有點高…… 2. blunt end ligation 這是另一個建議。 以前做的是切 pGEM-3z，在 SmaI 的 RE site，再 dephosphorylated。 而 insert 一律 PCR 量產純化後做 5'-end phosphorylation。 實驗室的處理過的 pGEM-3z vector，放在 -20℃ 超過五年後使用一樣 没問題。 作 blunt-ligation，我常加 PEG (final： 5% w/v)，但加了 PEG 就 不能做 heat-inactivation，所以，有時候這兩者會換著用。 3. 挑 colonies 以前挑 colonies，一定是確認有 insert 後才送定序。那個價錢差老 多了。除非 insert 長度太短，否則挑菌養養，跑 gel 看看有没有 band shift 現象，也就是和 vector alone 的 clone 進行 gel 位置的差異比對。 你的 vector size 才 2.7 Kb——唔，和 pGEM-3z 差不多嘛—— insert 就有 1.7 Kb，那差別非常大，在 gel 上是一目瞭然，用不着拿 RE 切就看得出來。 趕一點的，一大早養菌，傍晚就拿得出結果，可以準備拿可能的 clone 去定序。要不然，用 tips 挑 colonies，一邊 PCR 等結果，一邊拿 tips 去養菌…… 像是你在做的，如果要挑的菌太多，那用 colony PCR 會比較節省時間 没錯。但是 colony PCR，裡面東西太髒，如果 PCR condition 和 primers 不太好，那很容易誤判。你可以說明你在 colony PCR 用的 primers 是什麼 嗎？還有你 colony PCR 的 condition？ 4. Ligation Ligase 很貴的，看到你文章的內容，我還以為你一共加了 4ul 的 ligase。 一般我都只用 10 ul 來作用，然後 transform 時全下了 (約 100 ul 的 菌)。你拿 20 ul 作用，只取 5 ul 做 transformation，那剩下的是要 拿來幹什麼？拿來下次 transform 嗎？你覺得差不多三倍體積，結果會 差很多嗎？ T4 ligase 在作用完後，我們都會用 65℃ 來 heat-inactivation，除 非還另外加了 PEG。 T4 DNA ligase 因為頗貴又很脆弱，所以，剛買來時，我們實驗室一定 取冰過的、並且編號過的 vials，以 4 或 5 l 分裝冰入 -20℃ 冷凍保 存，要使用就登記依序開瓶。 5. 換 DNA polymerase 你既然有了已加 T-tail 的 vector，何苦還花時間自己在 PCR product 上加 A-tail？這個多出來的一步，還指不定是你 construct 的 rate- limiting step 呢。 用(買？)會加 A-tail 的 DNA polymerase 吧。反正你現在的要求是要 先接進東西。我記得一般 Taq 好像都會加 A-tail，但量產時有頗高的 SNP 出現？但出錯機率其實没想像中的高，能高到 1/1000 就要偷笑了。 就算出錯，可以再設計個 site-directed mutagesesis 把它修正回來， 頂多是多買一到三組 primers，比你一直搞半天的想塞卻塞不進東西好 太多了。 以上是我的意見，希望能幫得到你。 --

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